强直性脊柱炎（AS）是一种全身性炎症性疾病，据报道中国人群的患病率为0.29%。强直性脊柱炎可能造成不可逆的骨骼结构损伤和残疾，导致疲劳、睡眠障碍、精神疾病等，最终致使患者生活质量下降，并给医疗保健系统和社会带来巨大的经济压力。强直性脊柱炎疾病活动度指数（BASDAI）是衡量强直性脊柱炎疾病活动的常用指标，但由于其主观性和患者驱动的性质，存在一定局限性。现阶段关于强直性脊柱炎潜在生物标志物的蛋白质组学研究仍然有限，该领域的进一步探索对于了解强直性脊柱炎的发病机制以及确定新的诊断和治疗策略至关重要。
2025年5月，中国中医科学院广安门医院刘宏潇团队与国家蛋白质科学中心马洁团队在Journal of Advanced Research（IF=11.4）期刊上发表题为“Characterization of immune features and discovery of potential biomarkers for ankylosing spondylitis using deep plasma proteomics”的最新研究成果，利用深度血浆蛋白质组学描述免疫特征并发现强直性脊柱炎的潜在生物标志物。
北京青莲百奥生物科技有限公司为该研究提供基于MagicOmics DMB低丰度蛋白富集磁珠试剂盒的深度血浆蛋白质组学检测服务。
研究首先对发现队列（n=104，包括活动期强直性脊柱炎患者，n=48；稳定期强直性脊柱炎患者，n =21；健康对照者，n=35）进行血浆蛋白质组学分析，根据血浆蛋白质组学数据研究强直性脊柱炎的免疫特征和功能障碍；之后通过结合随机森林算法（RF）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），构建机器学习模型驱动的评分矩阵，发现蛋白质SAA1、FERMT3、ILK、TLN1可作为强直性脊柱炎的潜在生物标志物；最后，在验证队列（n=79，包括活动期强直性脊柱炎患者，n=27；稳定期强直性脊柱炎患者，n=28；健康对照者，n=24）中通过ELISA实现验证。
图1 强直性脊柱炎深度血浆蛋白质组学和生物信息学分析工作流程
值得一提的是，本研究的血浆蛋白质组学分析使用青莲百奥自研MagicOmics DMB低丰度蛋白富集磁珠试剂盒实现前处理，采用数据非依赖性采集（DIA）模式进行质谱检测，最终共鉴定到3891种蛋白质，蛋白质丰度分布达7个数量级，体现了血浆蛋白质组的深度覆盖。
强直性脊柱炎是一种与免疫性疾病密切相关的疾病，多种免疫细胞和炎症介质对其发病机制有显著影响；本研究根据血浆蛋白质组学数据通过CIBERSORT方法计算免疫细胞类型和比例，进而描述强直性脊柱炎患者的免疫学特征。
结果表明，记忆B淋巴细胞、M2型巨噬细胞、静息记忆CD4+ T细胞和初始CD4+ T细胞的比例在三组之间存在显著差异。与健康对照者相比，在活动期强直性脊柱炎患者中观察到静息记忆CD4+ T细胞数量显著增加；在稳定期强直性脊柱炎患者中观察到M2型巨噬细胞数量增加，表明其在强直性脊柱炎稳定中的潜在作用。
图2 基于血浆蛋白质组学数据的强直性脊柱炎免疫特征
与健康对照者相比，在活动期强直性脊柱炎患者中确定了376个差异表达蛋白质（DEP）。分析表明，203个上调蛋白质主要参与凝血、肌动蛋白丝组织、伤口愈合以及白细胞迁移等功能，173个下调蛋白质主要参与代谢过程、RNA加工、运输和定位以及翻译等功能。
图3 活动期强直性脊柱炎患者和健康对照者的蛋白质组学特征和功能分析
对这376个差异表达蛋白质进行k-means聚类表达趋势分析，在健康对照者、活动期强直性脊柱炎患者、稳定期强直性脊柱炎患者三组中揭示了四簇不同的聚类。其中：
簇1包含在活动期强直性脊柱炎患者中相比健康对照表达下调，但在稳定期强直性脊柱炎患者中恢复的蛋白质，主要富集于胰高血糖素信号通路、丙酮酸代谢和糖异生，这部分蛋白质的相关功能在活动期强直性脊柱炎患者中可能丧失；
簇4包含在活动期强直性脊柱炎患者中相比健康对照表达上调，但在稳定期强直性脊柱炎患者中恢复的蛋白质，主要富集于肌动蛋白细胞骨架的调节、黏着斑和趋化因子信号通路，这部分功能蛋白质的失调可能与强直性脊柱炎的病理进程相关；
簇2/簇3代表在活动期强直性脊柱炎患者中表达下调/上调，但在稳定期强直性脊柱炎患者中未能恢复到健康对照水平的蛋白质，主要富集于剪接体和核糖体通路/血小板活化、紧密连接等方面。
图4 强直性脊柱炎不同阶段的蛋白质组学特征
基于376个差异表达蛋白质构建了随机森林算法（RF）机器学习模型，用于区分强直性脊柱炎患者与健康对照者。模型以队列70%的样本为训练集，30%的样本为独立测试集，执行五折交叉验证。混淆矩阵显示，模型具有高精准度和理想召回率，强直性脊柱炎患者100%被准确预测为阳性病例，健康对照者91%被准确预测为阴性病例。模型的受试者工作特征（ROC）与精确率-召回率（PR）曲线下面积（AUC）分别达0.926与0.918，表明其能精准区分阳性与阴性病例，并以出色的准确性预测阳性结果。
图5 构建基于随机森林算法的模型区分强直性脊柱炎患者与健康对照者
首先，对基于随机森林算法的模型的分类准确率与基尼重要性进行排名，并将其映射到[0,5]的分值区间；之后，使用正交偏最小二乘判别分析，计算每个差异表达蛋白质在区分活动期强直性脊柱炎患者与健康对照者时的变量投影重要性（VIP）得分，并将VIP值排序并映射到[0,5]的分值区间，根据不同的阈值标准对其相应的校正后p-value进行划分并予以0-5的赋分；此外，将log2|FC|（以2为底的差异倍数绝对值的对数）排序并映射到0-5的分值区间，同样根据不同的阈值标准对其相应的校正后p-value进行划分并予以0-5的赋分；最终，整合上述所有评分参数构建生物标志物的评分矩阵，该矩阵中的平均得分指示每个蛋白质在区分强直性脊柱炎患者与健康对照者时的重要性。
图6 使用基于机器学习的评分矩阵识别强直性脊柱炎的潜在生物标志物
结合评分矩阵、功能分析和强直性脊柱炎不同阶段蛋白质表达趋势，确定蛋白质SAA1、FERMT3、ILK、TLN1作为强直性脊柱炎候选生物标志物。蛋白质SAA1、FERMT3、ILK、TLN1在活动期强直性脊柱炎患者中的表达水平均升高，在稳定期强直性脊柱炎患者中恢复正常水平，表明其可用作强直性脊柱炎的诊断和预后生物标志物。SAA1、FERMT3、ILK、TLN1预测强直性脊柱炎患者区分于健康对照者的判别效率分别为0.745、0.880、0.815、0.851；预测强直性脊柱炎从活动期到稳定期的判别效率为0.719、0.813、0.850、0.851，普遍高于ESR（红细胞沉降率，客观炎症标志物）的判别效率，与CRP（C-反应蛋白，客观炎症标志物）相当或与之相比略高。
对验证队列（n=79，包括活动期强直性脊柱炎患者，n=27；稳定期强直性脊柱炎患者，n=28；健康对照者，n=24）的血浆样本进行ELISA验证。观察到蛋白质SAA1、FERMT3、ILK、TLN1在三组间的表达趋势与蛋白质组学分析结果一致。利用这四种蛋白质构建组合模型，进一步使用ELISA数据对其进行验证，结果表明，该模型能有效区分活动期强直性脊柱炎患者与健康对照者。这体现了通过基于血浆蛋白质组学的评分矩阵筛选出的强直性脊柱炎生物标志物具备作为潜在药物靶点以及疾病判别候选标志物的潜力。
本研究提出了一种新策略，通过将蛋白质组学分析与基于机器学习的方法相结合，阐明强直性脊柱炎的病理机制并发现了生物标志物，并探索潜在治疗靶点。通过对不同阶段的强直性脊柱炎患者进行深度血浆蛋白质组分析，观察到几种蛋白表达水平的动态变化，这些蛋白质体现强直性脊柱炎的进展，并与其病理机制相关。最终，通过ELISA验证蛋白质SAA1、FERMT3、ILK、TLN1可作为强直性脊柱炎的潜在生物标志物。其中，FERMT3、ILK、TLN1参与整合素通路，该通路对细胞粘附和迁移、信号转导以及与细胞外基质的相互作用至关重要，表明其可能与在强直性脊柱炎中观察到的炎症反应有关。整合素通路中的相关分子可能作为强直性脊柱炎的潜在治疗靶点，需要进一步研究。
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