二硫键（Disulfide bond）是多肽和蛋白质中常见的一种翻译后修饰，是指氨基酸序列内2个半胱氨酸残基（—SH）发生氧化反应失去两个氢（—H）而形成的共价键键桥。二硫键的存在对于维持多肽的结构和功能具有重要作用。二硫键不仅赋予了多肽多种多样的生物活性，而且使多肽结构被锁定具有强的化学稳定性、酶稳定性、热稳定性等。

技术介绍

用含有NEM巯基封闭剂的蛋白提取液提取样本中的蛋白，经过TCA/丙酮沉淀纯化后，用不同的酶（组合）在适当条件下剪切成肽段。经过液相质谱联用仪采集数据后用pLINK-SS进行分析鉴定。

实验流程图

应用方向

基础医学、临床诊断：生物标志物的筛选，发病机制，靶向载体构建及治疗等生物医药：药物作用机理，药效评价等

微生物领域：菌株等生物体改造，靶向重组蛋白研发等

业生产及食品营养农：作物品种质量优化，食品品质及质地改良，食品安全检测等

二硫键蛋白组学案例解析

在蛋白质水平上鉴定天然二硫键

Mapping native disulfide bonds at a proteome sale

研究对象：Simple samples(RNaseA 、小鼠抗DAF-16单克隆抗体、一个10种等质

期刊：Nature Methods

影响因子：30.822

发表单位：北京师范大学生命科学学院

研究背景

长期以来人们一直不能直接在细胞内观察二硫键的形成，有关二硫键蛋白质组的形成与细胞功能关系的研究领域进展缓慢。以往的蛋白质二硫键定位方法，例如点突变、分步还原加差异烷基化处理、依赖手工解谱的质谱方法等等，不仅繁琐耗时，灵敏度低，而且仅适用于单个纯化蛋白。

在这篇论文中，作者开发了两套分别适用于简单样品和复杂样品中定位解离天然二硫键的酶解方法，以及配套的二硫键鉴定软件pLINK-SS的搜库结果。

研究策略

结果速递

形成二硫键的半胱氨酸残基之间的距离分析

蛋白中天然二硫键的位置对于生物体来说也是至关重要的。由于氨基酸序列某个位点的突变将会导致蛋白生物功能发生改变，然而分子间的二硫键的形成会增强蛋白的稳定性。本研究通过pLINK-SS鉴定及定位到许多涉及催化或与金属结合的半胱氨酸残基的调节性二硫键。分析E.coli周质及人体细胞中两个形成二硫键的半胱氨酸残基之间的距离，表明CXXC型最多。

随着分子生物学的发展，成熟的质谱技术也逐渐应用到二硫键的定位研究中，先将完整的蛋白质或多肽进行酶解成含有不同信息的肽段，经过质谱检测各个肽段的具体信息后，通过pLINK-SS对二硫键的配对方式进行表征，可以更好地研究生物中天然的蛋白信息，为其结构和功能提供依据。

图1 形成二硫键的半胱氨酸残基之间的距离分析

不同样品经pLINK搜库二硫键数目结果

文章对一些简单样本通过不同的酶组合进行处理，经pLINK搜库后鉴定到的二硫键数目。图1-A表示：使用不同蛋白酶（组合）在E.coli周质组份中鉴定的二硫键数目（括号中红色数字表示用该酶（组合）唯一标识到的数量）；图1-B表示：使用不同的蛋白酶（组合）在10中标准蛋白混合物中到的二硫键数目。

图2 pLINK搜库后鉴定到的二硫键数目

pLINK搜库二硫键定位结果

不同的样品中天然二硫键常常存在三种交联方式，相互交联（图2-a）、环交联（图2-b）、两个或多个二硫键交联（图2 -c）。

图3  pLINK搜库后鉴定到的二硫键位置

参考文献

Lu S, Fan SB, Yang B, Li YX, et al.. Mapping native disulfide bonds at a proteome scale. Nat Methods. 2015 Apr;12(4):329-31. doi: 10.1038/nmeth.3283. Epub 2015 Feb 9. PMID: 25664544.