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在哺乳动物表达的所有蛋白质中,超过50%的蛋白质可以再特定时间和亚细胞空间发生各种各样的翻译后修饰,并调控着许多重要的生物学功能。而赖氨酸是被频繁修饰的残基之一,其修饰包括磷酸化、乙酰化和丙酰化等。组蛋白赖氨酸修饰在调控酶的作用下招募结合蛋白,进而调控基因转录,改变了组蛋白与DNA的作用关系,因此蕴含着重要的生物学信息,它们的鉴定是理解其功能和解析表观遗传机制的关键。随着近年来生物质谱的扫描速度、灵敏度、分辨率的不断提高,越来越多新的组蛋白赖氨酸酰化修饰被鉴定。如赖氨酸琥珀酰化、巴豆酰化、丙二酰化、戊二酰化、2-羟基异丁酰化、β-羟基丁酰化等(图1,表1),深入揭示了这些新型赖氨酸酰化修饰对细胞的生长、分化、代谢等生命过程的特异性作用,如SIRT5通过调控琥珀酰化修饰水平参与线粒体代谢、三羧酸循环、脂肪酸代谢等机制。
酰化基团分子式展示
原理
由于带正电荷的ε氨基侧链,赖氨酸残基会受到各种不同翻译后修饰的调控。从相应的代谢中间产物酰基辅酶A中转移的酰基全都会中和赖氨酸的正电荷,然后影响底物蛋白功能的结构改变。受酰化调控的细胞功能,包括细胞周期调控、线粒体代谢、细胞骨架调节、蛋白质间的相互作用及其他功能。
赖氨酸酰化蛋白质组学技术使用专有的抗体,在进行LC-MS/MS分析之前富集胰蛋白酶消化样品中各自含酰基的肽。
丙酰化修饰组学案例解析
内皮细胞棕榈酰化循环协调外周动脉疾病的血管重构
Endothelial Palmitoylation Cycling Coordinates Vessel Remodeling in Peripheral Artery Disease
研究对象:动物模型小鼠 期刊:Circulation Research
影响因子:14.467 发表单位:华盛顿大学
研究背景
外周动脉疾病常见于代谢综合征和糖尿病,对医疗干预反应较差,其特征是慢性血管不成熟最终导致下肢截肢。棕榈酰化(S-酰化)即在棕榈酸酯和半胱氨酸之间形成硫酯键。蛋白质棕榈酰化促进与疏水性结构域的结合并且是可逆的。人们认为酰基蛋白硫酯酶1(APT1)对于主动去棕榈酸酯化很重要,但它在血管疾病中的生理机制尚不清楚。本研究确定可逆的棕榈酰化在内皮中维持血管成熟中的作用。
样本策略:小鼠的内皮细胞
技术策略:棕榈酰化TMT蛋白质组学验证策略:生化实验、免疫印迹法
结果速递
小鼠敲除内皮去棕榈酰化酶酰基蛋白硫酯酶1(APT1)减弱慢性后肢缺血( 一种周围动脉疾病的模型) 的恢复。内皮APT1缺乏症减少了纤连蛋白的加工, 破坏了黏附连接, 并抑制了体外管腔的形成。接下来研究人员通过蛋白质组学来表征APT1底物,将原代培养的小鼠内皮细胞中的棕榈酰化蛋白样品富集结合TMT标记蛋白组学进行定量分析。一共鉴定到超过3200个蛋白,其中有74种棕榈酰化蛋白质在基因型之间显著增加或减少(P≤0.05;肽段数≥2)。52种是候选APT1底物(基因敲除物中棕榈酰化程度增加,而该候选蛋白质的蛋白质丰度没有差异)。进一步分析显示促进血管成熟的R-Ras优先受到APT1缺乏症的影响。R-Ras被确认为APT1底物,点击化学分析表明APT1缺乏的细胞中R-Ras棕榈酰化增加。
图1:蛋白质组学结果显示R-Ras作为APT1底物
外周动脉疾病与糖尿病和代谢综合征有关。在db/db小鼠的内皮细胞中APT1酶活性降低。高血糖症会降低人脐静脉内皮细胞中的APT1活性,部分原因是APT1蛋白的乙酰化改变。点击化学分析表明,在高血糖情况下,R-Ras棕榈酰化增加。在糖尿病模型中发现改变的R-Ras运输,R-Ras棕榈酰化增加和纤连蛋白保留。由TIPT成像显示,由APT1缺乏引起的R-Ras去棕榈酸酯化的丧失限制了R-Ras膜运输的能力。
图2:糖尿病模型中R-Ras棕榈酰化增加,APT1酶活性降低
为了挽救细胞表型,通过一个带有插入的亲水域的R-Ras分子,以规避由于棕榈酰化代谢缺陷而引起的膜刚性。这种修饰纠正了R-Ras膜的运 输,恢复了纤连蛋白的加工,增加了粘附连接, 并挽救了APT1缺乏引起的管腔缺陷形成。
图3:R-Ras突变体可在体外挽救APT1缺乏症
这些结果表明,APT1依赖的棕榈酰化循环受乙酰化作用的控制,乙酰化作用是另一种动态形式的脂化作用,已知会影响参与非核蛋白的代谢。本研究结果提高了可能在药理上靶向另一种翻译后修饰(乙酰化) 以治疗通常难于治疗的外周动脉疾病的可能性。
参考文献
Wei Xiaochao,Adak Sangeeta,Zayed Mohamed et al. Endothelial Palmitoylation Cycling Coordinates Vessel Remodeling in Peripheral Artery Disease.[J] .Circ Res, 2020, 127: 249-265.
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