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修饰蛋白质组学
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糖基化蛋白质组学

糖基化蛋白质组学

  • 所属分类:修饰蛋白质组学
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  • 发布日期:2022-04-12 11:33:45
  • 产品概述
  • 案例解析

作为一种重要的翻译后修饰,蛋白质糖基化它参与和调控生物体的许多生命活动。随着蛋白质组技术的不断发展,蛋白质糖基化研究越来越受到广泛的重视。


技术原理

亲水相互作用色谱(Hydrophilic interaction liquid chromatography,HILIC)是基于富含多羟基的糖链结构的强亲水特性,采用极性固定相和非极性流动相的色谱技术,利用了糖肽由于糖链的加入而增强的亲水性,糖肽会有较长的保留时间,而使糖肽与非糖基化肽段得以分离的糖肽富集技术。HILIC对不同类型的糖肽没有偏性,且能保持糖链结构的完整性,适合作为完整糖肽结构研究中的富集技术。单一的N-糖蛋白的位点鉴定,蛋白Trypsin酶解成肽段后,HILIC方法富集糖肽,N-糖酰胺酶(PNGase)切除连接在天冬酰胺残基上的糖链(重水),再利用蛋白酶去除PNGase F,质谱分析。复杂样本糖基化蛋白及修饰位点的确定, 是运用的Byonic法, Byonic搜索引擎能够灵敏而多方面的对肽和蛋白质进行鉴定, 其配套的PreviewTM软件,可快速评估肽段质量误差、消化特异性以及Byonic后续多方面搜索的修改。

糖基化蛋白质组学数据分析流程图


技术优势

1.相关领域专业技术支持;

2.经验丰富的实验操作人员;

3.自主研发改进的具有技术的操作方法;

4.动物植物多种案例经验累积;

5.人才济济的生物信息分析团队。


应用领域

基础医学、临床诊断:生物标志物,疾病机理机制,疾病分型,个性化治疗等;

生物医药:药物作用机理,药效评价,药物开发等;

微生物领域:致病机理,耐药机制,病原体-宿主相互作用研究等; 

海洋水产:渔业资源,海水养殖,渔业环境与水产品安全等;


糖基化修饰蛋白组学案例解析


SARS-CoV-2峰值的位点特异性聚糖分析

Site-specific glycan analysis of the SARS-CoV-2 spike


研究对象:SARS-CoV-2病毒S蛋白             期刊:Science

影响因子:41.845                                      发表单位:英国南安普敦大学



研究背景

新型冠状病毒SARS-CoV-2(COVID-19的致病因子)的出现对全球人类健康构成了重大威胁。疫苗的开发集中在引起体液免疫反应的靶点,即刺突(S)糖蛋白,它介导细胞进入和膜融合。SARS-CoV-2 S基因编码22个N-连接的糖基序列,可能在蛋白质折叠和免疫逃逸中起作用。该研究采用位点特异性质谱方法, 揭示了重组SARS-CoV-2 S免疫原上的聚糖结构,展示了SARS-CoV-2 S聚糖与典型宿主聚糖加工的不同之处,这可能对病毒病理生物学和疫苗设计有影响。

样本策略:纯化的293F细胞重组的新冠病毒S蛋白

技术策略:基于质谱的糖基化蛋白质组技术


结果速递

为了解决SARS-CoV-2 S蛋白的位点特异性糖基化并可视化糖链异质体在整个蛋白表面的分布,研究人员表达纯化了293F细胞重组的新冠病毒S蛋白,SARS-CoV-2 S糖蛋白的示意图如下(图1A)。利用尺寸排阻色谱法纯化含有重组SARS-CoV-2 S的上清液,确保只分析天然的三聚蛋白(图1B)。用电镜负染对纯化的三聚体构象进行验证( 图1C)。然后分别用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和A裂解蛋白酶将S蛋白酶解成肽段,每个片段包含一种N-糖基片段,使用质谱法确定每个位点的聚糖组成。

图1. SARS-CoV-2S糖蛋白的表达及验证


通过质谱方法测定出S蛋白上的22个N-糖基化位点( 图2),其中18个糖基化位点在SARS病毒S蛋白中是保守的。研究人员发现S蛋白糖基化位点的糖链修饰分为寡甘露糖型、杂合型和复合型三种糖链类型,其中复合型糖链占比较高,不同糖基化位点的多糖种类和丰度差别较大。饼图总结了这些多糖的定量。根据寡甘露糖型聚糖含量将其着色,标记为绿色(80−100%)、橙色(30−79%)和粉红色(0−29%)的多糖位点。条形图表示三个生物学重复的平均值,误差条表示平均值的标准误差。

图2. SARS-CoV-2 S糖蛋白的位点特异性N-糖基化


研究人员利用S蛋白的电镜结构,将糖基化状态映射到了整个病毒S蛋白三聚体上, 揭示了N-糖基化如何在SARS-CoV-2 S蛋白整个表面上封闭不同的区域。结果表明SARS-CoV-2 S蛋白与其他病毒糖蛋白相比糖基化程度较低, 形成的“ 糖盾” 较少, 这有利于开发中和抗体。此外,复合型聚糖的处理是免疫原工程中的重要考虑因素。

图3. 基于结构的SARS-CoV-2 S N-连接的聚糖图谱


该研究对SARS-CoV-2的糖基化分析提供了天然折叠的三聚体刺突蛋白特有的位点特异性聚糖特征。随着越来越多基于糖蛋白的候选疫苗的开发,其详细的糖基分析为比较免疫原完整性提供了一条途径,并且随着生产规模扩大到临床用途,对监测也很重要。因此,在血清学检测试剂盒的生产中,聚糖谱分析也将是抗原质量的重要指标。然后随着以核苷酸为基础的疫苗出现,了解这些传递机制如何影响免疫原的加工和呈递至关重要。


参考文献

Watanabe Y, Allen JD, Wrapp D, et al. Site-specific glycan analysis of the SARS-CoV-2 spike[J]. Science, 2020, 369:330-333.

药物靶点(Drug Target)是指体内具有药效功能并能被药物作用的生物大分子,作为药物靶点的主要蛋白家族就有GPCR受体,离子通道、核受体、激酶等。自21世纪以来,基于靶点的药物发现模式逐渐取代了传统的基于药物化学结构的发现模式,成为现代创新药物研发的主流模式。

因此,事先确定靶向特定疾病有关的靶点分子是现代新药开发的基础。针对靶点的研究可以清楚疾病症结所在,从而确定了新药的研发方向。此外靶点的研究还有助于了解药物作用机制,进而对已有药物进行改造,研发出毒性更小、选择性更强、治疗效果更好的新药。

既然靶点研究如此重要,那么该如何去发现这些靶点呢?今天小编就给大家梳理下如何利用组学手段去筛选药物靶点以及研究药物作用机制!



文献案例1

双修饰蛋白组揭示肝母细胞瘤的潜在治疗靶点-HSPB-1


上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心潘秋辉教授和徐敏教授团队在知名期刊Signal Transduction and Targeted TherapyIF13.493)上发表题为“Global profiling of O-GlcNAcylated and/or phosphorylated proteins in hepatoblastoma”的研究论文。以肝母细胞瘤(HepatoblastomaHB)为研究对象,从蛋白质修饰组学的角度,对HB组织和正常肝组织进行大规模的磷酸化修饰和O-糖基化修饰鉴定,双修饰组学联合分析找到了肝母细胞瘤的潜在治疗靶点HSPB-1




研究思路

研究者首先应用4HB组织与正常肝组织进行蛋白质免疫印迹和免疫组化实验,研究者发现相较于正常肝组织,HB组织蛋白上存在较高的O糖基化修饰水平。又有先前研究表明O糖基化与磷酸化可能共同发生在蛋白相同或不同的丝氨酸或苏氨酸位点,因此研究者对上述样本又开展了O糖基化修饰与磷酸化修饰质谱分析



1WBIHC实验结果以及修饰组学工作流程


通过组学大数据和生信分析52%鉴定到的O糖基化蛋白同时被鉴定到了磷酸化修饰,这些蛋白主要与染色质调控,转录,翻译,转运以及细胞器组成相关。PPI网络分析发现双修饰的蛋白可能在部分细胞信号转导过程中发挥协同作用。研究者进一步根据其已知功能将具有O糖基化修饰的蛋白质进行分类(图2)。其中参与肿瘤发生过程的双修饰蛋白NPM1HSPE1以及HSPB1引起作者注意,并通过IP-WB进一步证实了其蛋白的磷酸化水平与O糖基化水平在肿瘤组织中与正常组织的差异变化。


2O.糖基化蛋白功能分类,每个红点代表一个O-糖基化修饰的位点
结合早期研究结论,作者锁定HSPB1可能是HB的潜在治疗靶点。研究者通过实验证明了在HB细胞系中HSPB-1存在O糖基化和磷酸化,且在82位丝氨酸位点,O糖基化与磷酸化存在竞争关系。此外,通过体外药物实验发现,HSPB-1O糖基化水平能够影响HB细胞对顺铂药物的耐受性,该结果进一步表明,HSPB-1可能是肝母细胞瘤的潜在治疗靶点。



参考文献

Song Hang,Ma Ji,Bian Zhixuan et al. Global profiling of O-GlcNAcylated and/or phosphorylated proteins in hepatoblastoma.[J] .Signal Transduct Target Ther, 2019, 4: 40.




文献案例2

OVID-19由SARS-CoV-2引起,重症患者多采取机械通气和预防继发感染等支持性措施,确诊和死亡率高,到目前为止还没有批准的药物可用于 COVID-19 治疗。因此,深入了解体液的分子和代谢变化至关重要。



2021年4月15日,李玉明等人在Signal Transduction and Targeted Therapy期刊(IF=13.493)上发表了题为Multi-platform omics analysis reveals molecular signature for COVID-19 pathogenesis, prognosis and drug target discovery的研究论文。该研究通过多组学联合的方法(蛋白质组学+代谢组学+脂质组学对COVID-19 患者血浆和尿液进行了分析,揭示了潜在的治疗靶点,解释了SARS-CoV-2感染机制,对药物研发、患者治疗和预后等提供了支持。



  • 文章标题:Multi-platform omics analysis reveals molecular signature for COVID-19 pathogenesis, prognosis and drug target discovery

  • 发表期刊:Signal Transduction and Targeted Therapy

  • 影响因子:IF=13.439

  • 蛋白组技术手段:DIA




实验设计






结果速递
1. COVID-19患者的血浆蛋白质组、氨基酸和脂质组谱

对三种人群(重症、非重症、健康)血浆样品进行DIA蛋白定量、脂质组和氨基酸检测,定量到1,254个蛋白质、664个脂质小分子和16种氨基酸,并对筛选到的差异物质进行聚类分析、时间序列分析、表达模式分析、功能注释等,分析了与SARS-CoV-2感染相关的异常表达物质。后期构建了随机森林机器学习模型,选择了 25 个重要变量,包括 4 种蛋白质和 21 种脂质。







2.预测患者 COVID-19 疾病严重程度的生物标志物特征

基于蛋白质组、氨基酸和脂质组数据构建了随机森林机器学习模型,优先选择了 25 个重要变量,包括 4 种蛋白质和 21 种脂质,可作为潜在的预测疾病严重程度的生物标志物。使用10名患者组成的血浆验证队列发现这25种物质中量化了19种分子,使用疾病患者尿液样本发现8 个分子能够被量化,这说明这25种物质可作为区分非重症和重症患者的潜在指标。







3. SARS-CoV-2感染多组学变化的工作模型
总结COVID-19患者血浆中的差异表达因子,寻找病毒感染和炎症反应中的关键蛋白(DEFA1、APOs、SAA1等)以及相应的脂质或氨基酸(Cs、TGs、PS等)。COVID-19 患者血浆中 PCs 丰度的降低揭示了巨噬细胞胆碱胞苷酰转移酶 α 的异常,该酶利用 PC 产生 CDP-胆碱。PS 表达细胞与免疫细胞之间的相互作用触发了免疫抑制途径,因此血浆中 PSs 上调揭示了感染期间存在免疫抑制。






4. SARS-CoV 感染的潜在治疗药物靶点发现
血浆中分子特征的丰度变化反映了 SARS-CoV-2 感染期间病毒-宿主的相互作用,研究人员分析了基于肺组织中富集蛋白质的潜在药物靶标和 HPA 中标注的食品和药物管理局 (FDA) 批准药物的靶标,确定了五种肺增强蛋白,包括 MRC1、组蛋白 H4、CCL18、SG3A1和 CLEC3B。此外,还确定了 FDA 批准药物的其他8种靶点(S100A8、S100A9、FGB、C5、ITGB3、KLKB1和 ANXA1),并根据网络分析确定了靶点对应的靶向药物。








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