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PRM靶向蛋白组相对定量

PRM靶向蛋白组相对定量

  • 所属分类:定性/定量蛋白质组学
  • 浏览次数:
  • 发布日期:2022-04-12 13:49:55
  • 产品概述
  • 案例解析

靶向蛋白质组技术,顾名思义是只选取和检测目标蛋白相关的信号,忽略其他无关的信号,因此可以实现对目标蛋白定量的高特异性和高准确性。PRM是Labelfree 、iTRAQ/TMT等组学技术的好伙伴。大规模组学技术不可避免地存在定量假阳性的问题,组学结果往往需要采用特异性的检测方法来验证。目前常规的方法如蛋白水平WB、ELISA,而PRM在后续靶蛋白验证方面具有独特的优势:不依赖抗体,可选择性、特 异性地对目标蛋白质进行定性定量分析(或定量分析)。

PRM(平行反应监测,Parallel Reaction Monitoring)是一种基于较高分辨、较高精度质谱的靶向蛋白质组学技术,能够对目标蛋白质、目标肽段有针对性的选择数据进行质谱数据采集,对于符合目标离子规则的信号进行采集,去除不符合规则的离子信号的干扰。从而实现对目标蛋白质/肽段进行定性定量。


技术原理

PRM是相对于传统SRM/MRM建立起来的高分辨率离子监测技术。PRM基于Q. Orbitrap为代表的四级杄-高分辨质谱平台,与SRM每次扫描一个Transition不同,PRM每次对一个母离子生的所有Transition进行全扫描,即平行监测了一个母离子对应的所有离子对。PRM质谱分析经过三个阶段:1,通过MS筛选岀与目标分子特异性一致的母离子;2,碰撞碎裂这些母离子,去其他离子的干扰;3.只对选定的特异MS/MS2离子进行质谱信号的采集。PRM质谱技术是高精准度的蛋白定量鉴定技术,是一次性精准定量硏究复杂样品中多个目标蛋白的绝佳方法。如果借助同位素标记的目标肽段作为内参,可以实现蛋白定量鉴定。


PRM技术流程图


技术优势

1.较高分辨离子监测,质量精度达ppm级,在不损失灵敏度的情况下,大程度排除了背景干扰;

2.MS2为全扫描,无需事先确定离子对和优化碰撞能量,只需要在数据处理时选择响应较高的一个或几个离子即可提取母离子对的色谱峰进行定量,线性范围可达5-6个数量级;

3.同时定性与定量分析,二级全扫描谱图用于定性分析,选择其中优质的子离子提取离子对即可完成定量分析。


与传统WB/ELISA相比有独特优势


应用领域

生物标志物验证 验证蛋白翻译后修饰 验证低丰度蛋白


PRM靶向蛋白组学案例解析


KIF5A依赖性轴突转运缺陷对三甲基氯化锡诱导的神经毒性中自噬通量的影响

KIF5A-dependent axonal transport deficiency disrupts autophagic flux in trimethyltin chloride-induced neurotoxicity


研究对象:Neuro-2a细胞         期刊:Autophagy

影响因子:10.1080                  发表单位:第三军医大学



背景介绍

三甲基氯化锡在工业和农业领域中广泛用作杀菌剂和塑料稳定剂的组成成分,普遍被认为具有有效的神经毒性,尤其是在海马中。然而,三甲基氯化锡诱导神经毒性的机制仍然不清楚。该研究通过蛋白质组学分析揭示了巨自噬/自噬溶酶体机制在三甲基氯化锡诱导的神经毒性中的重要作用,并确定了三甲基氯化锡受损自噬通量的关键靶标KIF5A。

样本策略:三甲基氯化锡处理后的Neuro-2a细胞技术策略:TMT标记定量


结果速递

1.通过细胞增殖实验以及Western Blo、荧光共定位实验证明TMT可以抑制细胞自噬及增殖。


2.对细胞样本的蛋白质组学分析中, 与对照组相比, 三甲基氯化锡组中共有 340种差异蛋白,其中204种蛋白上调,136种蛋白下调。通过对差异蛋白进行KEGG与IPA分析发现,自噬在三甲基氯化锡诱导的神经毒性中起到重要作用,且研究结果证明了三甲基氯化锡在Neuro-2a细胞中是一种有效的自噬抑制剂。


3.对蛋白质组学结果进一步分析, 发现参与调节Neuro-2a细胞中三甲基氯化锡损伤自噬通量的关键靶标蛋白KIF5A。进一步自噬通量表型研究发现KIF5A过表达可防止三甲基氯化锡诱导的神经毒性和自噬通量受损。使用基于

PRM的靶向蛋白质组学技术对KIF5A过表达进行靶向验证, 研究发现三甲基氯化锡诱导的蛋白表达趋势同样可以得到逆转。该研究将有助于理解轴突运输和自噬在环境应激引起的神经系统疾病发展中的作用。


Neuro-2a细胞暴露于TMT,通过蛋白质组分析其神经毒性的潜在靶标。发现自噬相关蛋白质在TMT作用后表达水平显著改变,表明自噬参与TMT诱导神经毒性这一过程。为探究TMT破坏Neuro-2a细胞内自噬流的分子机制,通过IPA分析分子作用网络,提示KIF5A很可能是TMT破坏自噬流的关键因子。进一步通过在体实验探究KIF5A在TMT破坏自噬流过程中的作用。在小鼠腹腔内注射TMT后,发现小鼠产生癫痫现象, 小鼠海马体大量神经元缺失, 溶酶体蛋白酶活性受损。最后, 通过小鼠的尾静脉注射AAV PHP.eB-Kif5a过表达KIF5A,发现自噬流紊乱恢复并逆转TMT诱导的神经毒性。



参考文献

Liu M, Pi H, Xi Y, et al. KIF5A-dependent axonal transport deficiency disrupts autophagic flux in trimethyltin chloride-induced neurotoxicity[J]. Autophagy, 2020, 1 -22. IF 11. 059

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