蛋白质组学

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石蜡包埋组织样本蛋白质组学

石蜡包埋组织样本蛋白质组学

  • 所属分类:特殊蛋白质组学
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  • 发布日期:2021-08-10 15:49:36
  • 产品概述
  • 案例解析

目前,蛋白质组学研究材料主要是新鲜的组织、体液或体外培养细胞,因为新鲜标本可以大限度保存蛋白质的结构完整性,防止蛋白质降解,从而得到完整的蛋白质表达谱。但新鲜标本的采集和保存需要较高的条件和费用,而可靠的生物标志物的发现需要大量的连贯性的样本,另外医学发展的趋势是对疾病的微创伤性进行早期诊断,以新鲜组织为样本进行大批量系统性的研究变得越来越困难。因此体液曾一度成为蛋白质组学的研究对象。但生物标志物须准确地反映疾病部位的病理变化,而体内微环境极其复杂且处于动态变化中,病变部位的化学信息很难在体液采集的部位达到质谱仪检测所需浓度,因此,针对体液的蛋白质组学研究很少发现有特异的生物标志物。体外培养细胞由于生长环境的改变, 不能完全反映细胞在体内的生物状态,也不是理想的临床病理学研究材料。当前世界各大医院及研究机构都有极其丰富的病变组织档案库,即甲醛固定及石蜡包埋的组织库,这些组织具有病史清楚、诊断明确、临床资料详尽等优点,并能长期稳定室温保存,对疾病的回顾性研究(尤其是罕见病例)具有极高的应用价值,已引起蛋白质组学研究人员的注意,并取得了初步的成果。但是,组织在固定和包埋过程中,蛋白质的结构及理化性质会发生改变,因此,在进行后续的检测之前,需要对蛋白质进行修复。



甲醛是由37%~40%甲醛10ml和90ml 磷酸盐缓冲液组成的混合物,甲醛终浓度为3.7%~4.0%。通过对组织进行甲醛固定及石蜡包埋等处理,组织细胞中的蛋白质—核酸和蛋白质一蛋白质之间及其分子内部迅速形成共价交联。甲醛的这种共价交联作用,能够阻止细胞器和生物大分子的移位,从而保存细胞微细的组织病理学形态,而石蜡包埋使组织可切成微米级薄片,使光镜观察组织结构成为可能,并使包埋组织长期室温储存,但同时使蛋白质的理化性质发生部分改变,如溶解度明显下降、胰蛋白酶切位点部分丢失、热稳定性增高、等电点pH值改变等,蛋白质在甲醛中仅20min就可形成二聚体、三聚体甚至多聚体,某些抗原决定 簇位点被掩盖。因此,要使甲醛固定的组织适用于蛋白质组学的研究,蛋白质的复性是首要解决的问题。


FFPE样本的蛋白组学案例解析


从快速获得的蛋白质类型中学习甲状腺结节的蛋白质分类器

Protein Classifier for Thyroid Nodules Learned from Rapidly Acquired Proteotypes


研究对象:甲状腺结节患者和健康供体

发表单位:西湖大学



研究背景

甲状腺结节,即甲状腺内部出现包块。甲状腺位于颈前方气管两侧偏下一点的位置,紧贴在气管上, 所以如果甲状腺出现包块,能够发现包块可以随吞咽上下活动。甲状腺结节,包括良性结节和恶性结节, 良性结节主要以甲状腺腺瘤或者结节性甲状腺肿大为主, 而恶性的结节也就是甲状腺癌。据报道多达30%的甲状腺结节无法通过细胞病理学准确确诊为良性或者恶性。虽然基于核酸检测可以提高甲状腺结节病理诊断的准确性,但是仍然不可避免的发生误诊,导致一部分患者进行非必须的甲状腺切除术。该研究利用DIA定量蛋白质组学对上千个FFPE甲状腺结微量组织蛋白表达进行了准确分析,结合人工智能,鉴定到可区分甲状腺良性结节或恶性结节的生物标志物,为甲状腺结节的患者的诊断和治疗带来曙光。


研究策略



结果速递

52个DDA文 件 的FFPE组 织DDA建 库 分 析 共 采 集 到5,190个蛋白质,33,802个肽段。579例发现样本中共鉴定到3,708蛋白,30,915个肽段。甲状腺结节根据良恶性程度不同, 包括正常甲状腺组织( N),多结节性甲状腺肿(MNG),滤泡性甲状腺肿腺瘤(FA)、滤泡癌(FTC)和乳头状癌(PTC)。研究通过多种算法来可视化不同类型的组织蛋白,研究发现不同组织类型的表达相对隔离,但是同一类型的不同亚型之间相对有较高的重叠,不易区分。

图1. 热图和UMAP分析图


研究团队进一步使用机器学习中的人工神经网络技术,即一种“模仿”人脑,由大量的节点(类似人脑中的“神经元”)相互联接构成的运算模型,对良性与恶性结节的蛋白组数据进行了分析,筛选到包含14个关键性蛋白的蛋白标志物组合(表2),能够对良性与恶性甲状腺结节进行有效区分。

表2. 14种关键性蛋白


后续通过两批样本进行了验证分析。结果显示228例回顾性样本的表达ROC曲线面积达0.95,精度值达0.91以上,t-SNE图显示表明良性结节与恶性结节之间存在明显的区分;同样64例前瞻性样本的表达ROC曲线面积达0.89,精度值达0.87。证明了上述标志物的准确性。

图3. ROC曲线及t-SNE分析结果图


综上所述,研究人员队通过上千列甲状腺结节组织样本进行了系统的蛋白质组学分析及验证,鉴定到包含14个蛋白标志物组合,能够有效的对甲状腺结节组织的良恶性进行区分。为临床甲状腺结节的治疗提供了强有力的理论支持,另外由于人工智能的使用,也为蛋白质组学的分析提供了可借鉴的方法。


参考文献

Protein Classifier for Thyroid Nodules Learned from Rapidly Acquired Proteotypes. MedRxived, 2020.

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