外泌体在1980年首次被发现，被认为是活细胞的排泄废物。其径粒约为30-150 nm，广泛散布于各类体液及植物中，受脂质双分子膜的保护，内容物稳定，在丰度和稳定性上有明显的优势，其组成成分主要为蛋白质、核酸、脂质等。它们在分泌细胞和受体细胞之间穿梭介导了细胞间的生物分子传递，是不同组织细胞间信息沟通的重要媒介。

技术特点及优势

1.多种提取方案满足不同需求：超速离心法金标准；TiO2 适合微量样本；

2.全系列表征：NTA，电镜，WB，纳米流式一站式解决；

3.多组学联合分析：全转录组学、蛋白质组学、代谢组学全覆盖、差异筛选；

4.验证无忧：1mL血清外泌体蛋白组学，从差异蛋白筛选到靶向验证。

应用领域

• 细胞外囊泡在体内可促进肿瘤发生，控制转移灶形成和肿瘤免疫反应

• 在心血管疾病方面，可作为心血管系统传递的载体，对心脏重塑、血管形成具有病理作用

• 尿液中的外泌体可作为肾脏疾病的潜在生物标志物，反应从足细胞到肾小管的病理变化

• 在肝脏疾病和神经退行性疾病中也会作为相关疾病蛋白的载体，成为早期诊断的潜在生物标志物

研究意义

1，细胞外囊泡可携带生物学信息并作用于受体细胞，有助于内环境的稳定，成为某些疾病进展的关键调节因子；

2，可作为临床疾病诊断的一种可靠生物标志物，在疾病诊断、预后判断、疾病治疗中方便为患者提供更多的治疗方案；

外泌体的分离纯化

外泌体的分离和纯化是外泌体蛋白质组学研究的前提。外泌体的提取方法包括TiO2富集法、超速离心法和试剂盒法等，每种方法各有其优缺点，方法的不同对所提纯的外泌体大小，形态，密集程度等有所影响。

TiO2富集法：外泌体在TiO2表面化学吸附的驱动力是磷脂双分子层上的磷酸基团和TiO2之间的配位键。由于磷脂双分子层的柔韧性，可以弯曲以促进与TiO2表面的多位点相互作用，因此可以实现特定而牢固的结合。由于其简单性和高度的亲和力，这种基于共价结合的选择性富集方法，具有富集效率高，非特异性吸附少，样品处理时间短等方面的优势。

超速离心法：超速离心分离外泌体是目前使用广泛的一种方法，也是目前公认的金标准。其原理是根据外泌体与细胞不同组分的沉降系数不同，利用不同强度离心力使样品中死亡细胞、细胞碎片、细胞器等组分被分离出去，然后获得外泌体及部分受到污染的蛋白，用PBS再次重悬清洗离心后即可获得实验所需外泌体。超速离心的优点是能够大量处理样本，且与其他方法相比提取的外泌体形态及后续的外泌体鉴定与经典文献描述相似，因此是目前公认的提取外泌体有效可靠的方法。

细胞样本：细胞样本的培养基使用量取决于细胞系以及培养状况，细胞系不同外泌体的释放量有很大差别，外泌体释放量高的细胞系几毫升培养液就足够；释放量低的则需要上百毫升。一般来说一个普通的细胞系，用超离分离外泌体，预实验（摸索条件）起始培液量50ml以上（直接正式实验建议100-500ml）。细胞培养过程中可以使用无外泌体血清培养基培养，也可以使用含有外泌体的血清培养细胞到一定密度（70-80%），然后吸去培养液，PBS洗数次之后换无血清培液进行培养（建议无血清培养48h后收集细胞上清）。

血液样本：目前认为血清中外泌体的含量还是比较高的，用促凝管或者抗凝管收集全血3000rpm 4℃ 离心10min，取上清，液氮速冻，保存于-80℃，一般需要3-5ml的血浆/血清样本。

试剂盒法：近年出现了各种用于分离纯化外泌体的商品化试剂盒，目前常用的是由SystemBiOsciences（SBI）研发的EXOQuick试剂盒，该系列的试剂是基于多聚体形式的Exosome提取试剂，形成类似于网状结果，将一定直径的微泡捕获出来，快速有效的提取各种体液样本中Exosome。

外泌体的表征 

2015国际细胞外囊泡协会指南中给定了这三个实验联合鉴定外泌体的方法。三个实验是相互佐证的 使用电镜来观察你的样品中是否有与外泌体相似的经典结构，有经典结构说明你的样品中有外泌体或者与外泌体类似的如溶酶体、蛋白聚团、支原体等结构；纳米颗粒追踪分析技术( nanoparticle tracking analysis，NTA)检测外泌体大小以及数量；WB检测发现样品中具有外泌体的标志物，那就一定程度上排除了溶酶体、蛋白聚团、支原体等情况。

外泌体蛋白质组学案例解析

一种基于磷脂双层与TiO2特异性相互作用的血清外泌体分离新策略

A novel strategy for facile serum exosome isolation based on specific interactions between phospholipid bilayers and TiO2

研究对象：胰腺癌患者和健康供体          期刊：Chemical Science

影响因子：9.346                                   发表单位：北京蛋白质组研究中心

背景介绍

外泌体是细胞衍生的，具有磷脂双层封闭结构的囊泡。其在细胞间相互作用中起重要作用并调节许多生物过程。越来越多的证据表明，血清外泌体是癌症早期诊断的潜在生物标志物。为了有助于肿瘤分泌的外泌体的下游分子分析，对纯化的外泌体具有较高要求。然而，目前用于外泌体分离的技术耗时且高度依赖于仪器，并且仅具有有限的特异性和回收率。因此，基础研究和临床应用都需要快速有效的外泌体分离方法

研究策略

结果速递

研究人员对TiO2吸附参数进行了研究。当TiO2微球的量从0.5mg增加到10 mg时，分离效率相应提高，在2 mg TiO2处达到95.0％的最大效率， 而TiO 2量进一步增加则导致分离效率降低。因此， 使用2 mg TiO2进行最佳孵育时间评估。 随着孵育时间从 30 s延长到 5 min，分离效率从53.1％增加到93.4％。当孵育时间延长至10 min时， 分离效率会略微提高至95.5％。基于对时间要求和分离效率的综合考虑，选择5 min作为最佳孵育时间。

图1. 外泌体分离条件的优化

为了证明基于TiO2的外泌体分离策略的可行性，研究人员将其进一步应用于人血清样品，并通过蛋白质组分析将其与传统方法（超速离心和共沉淀试剂盒）进行了比较分析。用TiO2从3个生物重复的100 μL血清样品中分离的外泌体中共鉴定到384个蛋白， 明显高于超速离心法（228个蛋白）和商业共沉淀试剂盒法（252个蛋白）所测得的结果。总而言之，与目前可用的人类血清外泌体分析方法相比，基于TiO2的策略显示出更好的外泌体分离效率并可减少非特异性蛋白质的吸附。

图2. 三种方法比较的韦恩图

使用基于TiO2的策略，从9位健康供体和9位胰腺癌患者的血清样本中分离出外泌体。从健康组和胰腺癌组中共鉴定到433和581个血清外泌体蛋白。与健康组相比，胰腺癌组中鉴定出59种上调蛋白和6种下调蛋白。使用65种差异蛋白的表达数据，通过无监督的层次聚类分析将来自两组的样品重新分组。如预期的那样，胰腺癌组和健康组可以很好地分开，这表明使用外泌体蛋白谱进行胰腺癌患者生物标志物筛选的潜力。

图3. 聚类热图

该研究通过利用TiO2与外泌体脂质双层上的磷酸基团的特异性相互作用，从人血清中简单快速地分离外泌体。这一策略利用了高度亲和力的结合，模型外泌体可以可逆地分离。下游表征和蛋白质组分析表明， 该分离方法具有高回收率（93.4％），耗时短（5分钟内）的特性。最后通过比较胰腺癌患者和健康供者的血清外泌体，蛋白质组学分析表明，许多差异表达的蛋白质与癌症的发生和发展密切相关，这表明该策略有可能用于大规模基于外泌体的生物标志物筛选，并用于癌症诊断。

参考文献

Gao F, Jiao F, Xia C, et al. A novel strategy for facile serum exosome isolation based on specific interactions between phospholipid bilayers and TiO2[J]. Chem Sci, 2019, 10:1579-1588.