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DIA定量蛋白质组学

DIA定量蛋白质组学

  • 所属分类:定性/定量蛋白质组学
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  • 发布日期:2022-07-15 16:01:07
  • 产品概述
  • 案例解析

DIA技术(data-independent acquisition,数据非依赖采集)融合了传统蛋白质组shotgun的较高通量和质谱定量金标准PRM的定量较准的优点,被Nature Methods杂志评为2015年值得关注的技术。


技术原理

传统的蛋白质组技术shotgun、Label free、iTRAQ/TMT等在数据采集过程中存在较高的数据丢失和采集的随机性即DDA(data-dependent acquisition)的采集方式。在这个采集过程中,每个扫描周期内, 质谱只对丰度较高的信号进行二级信号采集,其余信号的二级信号则丢失了。

而DIA(data-independent acquisition)技术原理是将所有的信号预先划分为几块,然后对每块区域里面的所有一级信号,全部一次性进行二级采集。从而实现了多方面的覆盖性,以及在此基础上的重现性。

DIA模式下的信号采集窗口展示


DIA技术优势

1. 稳定性较好:与传统的DDA采集模式相比,是无偏好的全息扫描,获得的信息丰富,解析出的蛋白较普通LFQ方法多,稳定性比较好,缺失值相对较少。

2.定量准确度较高:定量准确度与PRM技术相当。

3.适用范围广:单个样本上机,能进行一定程度上的有或无鉴定,能用于不同组织类型蛋白表达谱的比较。

4.时间跨度大:样本中加入了保留时间校正的标准肽段,不受上样时间限制,能够对不同时间上机的样本进行保留时间校正后,进行整体数据分析,更适合大样本量,疾病类样本。


实验流程

DIA定量蛋白组学案例解析


血清蛋白质组学鉴定银屑病及其中药疗效的生物标志物

In-depth serum proteomics reveals biomarkers of psoriasis severity and response to traditional  Chinese medicine


研究对象:血清          期刊:Theranostics

影响因子:8.712         



研究背景

血清和血浆含有丰富的生物学信息,可以反映人体的生理和病理状况,因此是疾病生物标记物的宝贵样本类型。但是,由于血清中蛋白质的浓度范围很广,因此对血清蛋白质组进行全面的分析具有挑战性.为解决这一挑战,作者通过将DIA-MS与可定制的抗体微阵列相结合,开发了一个深入的血清蛋白质组学技术平台,全面测定银屑病患者的血清蛋白质组将有助于更好地了解银屑病的发病机理,并确定诊断和治疗的生物标志物.

样本策略:银屑病患者血清和健康対照血清

技术策略:抗体微阵列,DIA

验证策略:ELISA


结果速递

1、通过文献挖掘,共找到129种与银屑病相关的血液蛋白。基于这些蛋白的抗体制作抗体微阵列,对16例健康人血清、23例银屑病患者血清、11例经12周银屑灵治疗的银屑病患者血清进行蛋白质检测, 发现抗体微阵列检测血清蛋白的重现性较高。对比银屑病患者血清和健康人血清, 发现除了已知的银屑病标志物外,还鉴定到新的在银屑病患者血清中发生丰度变化的蛋白。

银屑病特异的抗体微阵列


2、通过QE-HF质谱仪对各组血液样本进行DIA检测,共鉴定到283个特异性肽段。对DIA技术进行重复性评价,结果表明样本间的Pearson相关系数均值为0.85,平均变异系数为4.17%。对银屑病患者组和健康对照组进行比较发现58种差异蛋白,其中有已知的炎症和凝血相关蛋白。

DIA检测银屑病患者血清蛋白


3、经过生物信息学统计分析与临床指标的相关性分析结果表明58个差异蛋白(P <0.01)可显著区分银屑病患者和健康对照,基于这些差异蛋白进行主成分分析,也同样可区分两组,其中一个蛋白PFN1在DIA和抗体两种技术的定量结果中,均在银屑病患者和健康对照组中有显著差异。在发现集和独立验证集中,用

ELISA技术对PI3进行验证,结果均表明其在银屑病患者组中较高表达。说明其找到的差异蛋白可能成为银屑病的潜在标志物。进而选取了11例银屑病患者,经12周的银屑灵治疗,结果有6例患者治疗有效,5例患者治疗无效。对药物治疗前的治疗有效组(n = 6)和治疗无效组(n = 5)患者血清蛋白进行比较分析,发现了12种差异表达的蛋白(p<0.05)。对这些蛋白在治疗后的表达值进行检测,发现有效组中FCN2,MIF和MMP1的血清丰度一致高于无效组,表明其可作为预测银屑灵治疗效果的潜在生物标志物。


血液中包含了丰富的生理、病理信息,是疾病生物标志物研究领域的重要材料。然而血液蛋白浓度动态范围较广、高丰度蛋白含量较高,导致血液蛋白质组鉴定难度大。本文通过DIA技术和抗体微阵列技术,以银屑病为疾病模型,对银屑病治疗前、银屑病中药(银屑灵)治疗后、健康对照共50例血清样本建立蛋白质表达谱。鉴定到了106种参与血液凝固、炎症、细胞凋亡和血管生成等银屑病相关生物过程的差异蛋白。聚类和主成分分析发现58种蛋白可区分健康组和银屑病患者,12种蛋白可预测中药治疗效果,相关性分析发现三个血清蛋白( PI3,CCL22,IL-12B)与银屑病面积和严重程度指数( psoriasis area and severity index,PASI)评分呈正相关。质谱DIA技术适合大规模临床样本的检测,抗体微阵列技术可补充质谱无法鉴定到的血清低丰度蛋白,本文结合DIA技术和抗体微阵列技术互相弥补对方缺点,使鉴定多的蛋白数量多化。


参考文献

Xu M, Deng J, Xu K, et al. In-depth serum proteomics reveals biomarkers of psoriasis severity and response to traditional Chinese medicine[J]. Theranostics, 2019, 9 (9): 2475-


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结直肠癌(CRC)是全球第四大致命性癌症,每年有近90万人死亡。衰老、不良的饮食和生活方式都会增加结直肠癌的风险。尽管治疗手段不断进步,但是对于CRC,特别是转移性CRC的死亡率在癌症中仍然很高。2020年11月9日,中国科学院上海生化细胞所吴家睿,曾嵘团队及海军医科大学张卫团队合作在Cancer Cell上在线发表了题为“Integrated Omics of Metastatic Colorectal Cancer”的研究论文,该研究通过基因组、蛋白组、磷酸化蛋白组学多角度系统的分析了转移性结直肠癌的分子特征,为CRC的预后评估和个性化治疗提供理论依据。



天津蛋白质组学



样本策略

76例早期-非转移性CRC和70例转移性CRC患者的480个临床组织:原发灶和转移灶(T)、近端癌旁(P)和远端正常组织(N)、远处肝转移组织(LM)外周血细胞(BC);

技术策略

全外显子测序、DIA蛋白组学、DIA磷酸化蛋白组学

技术路线




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实验结果

多组学研究概述

该研究采用多组学方法对146例中国结直肠癌患者(CCRC)的不同组织部位进行分析。作者对330个样本进行了全外显子组测序(WES),并采用DIA技术得到了来自480个样本的蛋白质组和磷酸化蛋白组数据,共检测到8450个蛋白和47786个磷酸化位点的定量结果。

中国CRC患者的突变特征

对146例患者组织样本的基因组学检测结果表明,常见的癌症相关突变基因为APC(百分之65的突变频率)、TP53(百分之64)和KRAS(百分之32)。接下来研究人员将我国CRC队列(CCRC)与TCGA和MSK的CRC数据集进行比较,研究发现三个队列临床病理特征存在明显差异,其中CCRC中CRC的发病率及转移性CRC(mCRC)的比例很高.




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图1. CCRC的基因组突变图谱


基于蛋白质组学数据的亚型分类

作者对原发性肿瘤和对照组之间的2440个差异表达蛋白通过共识聚类共分成3种亚型(CC1、CC2和CC3)(图2A)。CC1集中在RNA加工和DNA错配修复(MMR);CC2集中在细胞外基质-受体整合、粘着斑和免疫相关途径;CC3集中在DNA复制和代谢途径激活。三种亚型具有不同的没有复发生存率,与CC1和CC2亚型中的mCRC患者相比,CC3中的mCRC患者的没有复发存活的概率很低(P = 0.004;图2C)。相比之下,非mCRC患者在三个亚型中没有显着的复发存活差异。



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图2. CCRC的蛋白质组学亚型和每个亚型的临床意义



磷酸化蛋白质组图谱鉴别mCRC与非mCRC

基于磷酸化蛋白组数据,在原发性肿瘤和对照组中共鉴定到1487个差异磷酸化位点。对其进行共识聚类,将其分成6个磷酸化蛋白质亚型(图3A、3B)。其中SC1、SC3和SC5富含mCRC患者,而SC2、SC4和SC6富含非mCRC患者。功能富集分析发现在SC1、SC3和SC5中高表达的磷酸化蛋白在粘附相关通路中显著富集(图3C)。而SC2、SC4和SC6中上调的磷酸化蛋白在ERBB2信号转导、子宫内膜癌、抗原加工和提呈以及FcγR介导的吞噬途径中显著富集(图3C)。基于PhosphoSitePlus数据库的激酶-底物关系,研究发现在SC1、SC3和SC5中,激酶和磷酸化位点之间大多呈负相关,而在SC2和SC4中,正相关较多(图3D)。



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图3. CCRC中的磷酸蛋白质组图谱



磷酸化蛋白质组学为mCRC提供可用药靶点

对于具有可量化蛋白水平和临床可操作药物的激酶,作者分析了42对mCRC的N-T或N-LM组织中相应的磷酸底物丰度(图4B和4C),共发现了251对激酶-磷酸底物。我们观察到mCRC患者不同组织和蛋白质亚型中磷酸底物和激酶的高度异质性(图4B)。接下来,根据每两对激酶-磷酸底物之间的皮尔逊相关系数,构建了每种蛋白质亚型中原发和转移肿瘤的激酶-底物网络(图4C)。



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图4. 磷酸底物与相关激酶的富集



为了进一步探索mCRC患者的药物反应潜力,研究人员在31个miniPDX模型上进行了三种激酶克制剂(阿法替尼、吉非替尼和雷戈拉非尼)的药理学测试,其中包括9对原发转移肿瘤和13例其他原发肿瘤。通过肿瘤细胞生长克制(TCGI,百分比)来测量每种肿瘤对每种药物的药物反应效果,发现来自同一个体的原发性和转移性肿瘤对相同药物可能表现出不同的反应(图7B)。此外研究人员还根据1696个边缘强度特征构建了弹性网络回归模型,用于预测药物反应。这些结果表明,激酶-磷酸底物网络在预测mCRC患者的药物敏感性方面具有很强的潜力。



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图5. 激酶-底物网络分析和miniPDX药物测试


总结

该研究专注于mCRC的多组学数据并提供了原发性和转移性肿瘤的全球特征图谱。基于对转移性肿瘤和原发性肿瘤在蛋白质组和磷酸化蛋白质组图谱上的差异的观察,作者发现网络分析结合蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学数据可以准确地反映药物反应。这些结果强烈表明,在选择IV期患者的治疗方案时,应考虑原发灶和转移灶组织中的蛋白质组/磷酸化蛋白质组图谱,以便采取有效的个体化治疗策略。


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