蛋白质组学

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蛋白质组学,糖基化蛋白质组学,多组学联合分析
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干货系列:多组学关联分析及组学分子实验验证方法(表观组+转录组+微生物组)

2023-11-15 00:00:00

上世纪60年代末,分子生物学中心法则(Genetic Central Dogma)从分子水平揭示生命遗传信息的传递奥秘。这一中心法则:DNA转录生成RNA,RNA翻译产生蛋白质,蛋白质反过来协助前两项流程,并协助DNA完成自我复制。蛋白质作为处于中心法则下游,且是生命活动的重要的执行者,其在生命及疾病发生发展过程中的意义不言而喻,因此,如同人类基因图谱的重大意义,后基因组时代对人类蛋白质组的系统性研究势在必行。

蛋白质组学


2.1 什么是蛋白质组


蛋白质组(Proteome)指一种基因组所表达的全套蛋白质,即包括一种细胞或一种生物所表达的全部蛋白质。

2.2 什么是蛋白质组学

蛋白质组学(Proteomics)是以蛋白质组为研究对象,研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学。本质上是大规模水平上研究蛋白质的特征,包括蛋白质的表达水平,翻译后的修饰,蛋白与蛋白相互作用等,由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生,细胞代谢等过程的整体而全面的认识。

2.3 蛋白质组学研究的内容

2.3.1 蛋白质定性:蛋白质组学的内容之一就是蛋白质鉴定。鉴定特定细胞、组织或器官的蛋白质种类(蛋白质组全谱鉴定)。传统的方法如蛋白质微量测序、氨基酸组成分析(如Edman降解法)费时费力、通量低,存在不容易实现规模化和自动化,结果灵敏度差等问题。当前主流的基于软电离技术的液相色谱-质谱系统(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,LC-MS/MS)是实现高通量蛋白组全谱鉴定的主要方法。

2.3.2 蛋白质定量:研究特定条件下蛋白质的表达量变化(定量蛋白质组学)。例如在许多疾病的发生和发展过程中,常常伴随着某些蛋白质的表达异常。定量蛋白质组学就是把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂的混合体系中所有的蛋白质进行的定量和鉴定。定量蛋白质组学技术主要分为标记(Label)和非标记(Label free)定量策略,标记策略又分为体内标记和体外标记两种。

2.3.3 蛋白质功能:明确蛋白质在生命活动中执行的功能(功能蛋白质组学),揭示蛋白质之间复杂的相互作用机制(相互作用蛋白质组学)。如分析酶活性和确定酶底物,细胞因子的生物分析/配体-受体结合分析。可以利用基因敲除和反义技术分析基因表达产物——蛋白质的功能,另外对蛋白质表达出来后在细胞内的定位研究也在一定程度上有助于蛋白质功能的了解。

2.3.4 蛋白质结构:研究蛋白质的二维、三维、四维结构(结构蛋白质组学)以及蛋白质翻译后修饰(修饰蛋白质组学)。通过理论研究计算推导预测蛋白质的空间结构,或者探索蛋白质在结构变化过程中各种光学、物理学等特征变化来了解蛋白质结构信息。利用液相色谱-质谱系统(LC-MS/MS)结合数据库检索的方法,实现对目前所有已知的修饰位点磷酸化,乙酰化,泛素化进行鉴定。对蛋白质结构的研究可以有助于深入理解其功能机制,也可以帮助进行药物筛选和设计思路优化。

目前研究主要集中在蛋白质组表达模式方面,但是蛋白质功能模式的研究是蛋白质组研究的目标。


3.1 蛋白质定性分析:确定样品中是否有蛋白质存在,以及存在的是何种蛋白质


蛋白质定性分析通常是指利用质谱法进行蛋白质鉴定和序列分析。蛋白质定性分析分为top-down分析和bottom-up分析两种策略。目前,bottom-up分析策略被更广泛的应用于蛋白质定性分析工作。

Bottom-Up(自底向上)和Top-Down(自顶向下)两种策略“自底向上”策略是指通过分析由蛋白质酶解生成的肽段来鉴定蛋白质。当应用该策略来分析蛋白质组混合物时,因其类似于基因组测序的鸟枪法,所以又被称为鸟枪法蛋白质组学(Shot-gun Proteomics)。“自顶向下”策略直接鉴定完整蛋白质,在翻译后修饰和蛋白质同素异构体鉴定方面有一些潜在的优势。可是该策略的缺陷是蛋白质在气相中分离、电离及碎裂都十分困难。而鸟枪法蛋白质组学由于将蛋白质酶解成肽段,使其在气相中更容易被分离、电离和碎裂。

3.2 蛋白质组学定量技术

蛋白质定量分析:确定样品中总蛋白含量,或者某种单一蛋白成分的含量。

3.2.1基于非标记蛋白质组学定量技术

非标记定量(Label-free quantification, LFQ)即不需要对样品进行任何标记操作,直接分别对每个样品进行样品处理和质谱检测,得到每个样品各自的质谱数据后一起进行分析得到蛋白的定量信息。


非标记定量按照采集模式分,可以分为一下两种: 


(1)数据依赖采集(DDA):DDA的扫描过程包含一个Full MS1 scan和若干张 MS2 scans。质谱会根据参数的设定,四级杆对一级质谱图中的肽段母离子按照信号强度由高到低进行选择,送到碰撞室进行碎裂,然后扫描得到对应肽段母离子的二级质谱图(MS2spectrum)。DDA是目前蛋白质组学研究领域使用频率高、分析方法成熟的质谱扫描模式。缺陷在于偏向于采集样品中相对丰度较高的分子,遗漏相对丰度较低的分子,这种随机性对检测的重复性有不利影响。

(2)数据非依赖采集(DIA):蛋白质酶解后的肽段质谱检测时的质荷比(m/z)分布在300-1800之间。DIA扫描时,可以在质谱采集方法中将300-1800 m/z这范围分为若干个窗口,每个扫描循环中,包含一张Full MS1 scan,和若干个 MS2 scans,这里每个MS2scan采集的是每个窗口中所有肽段母离子一起打碎后的碎片离子。可以看出,与DDA中的MS2scans不同,DIA不依赖于Full MS1 scan中肽段母离子的丰度进行依次挑选,DIA的MS2 scans得到的是混合的二级质谱图,而不是DDA中对应单个选定的肽段母离子的二级质谱图。


3.2.2 基于标记蛋白质组学定量技术


iTRAQ和TMT分别是SCIEX公司和Thermo公司推出的蛋白质组定量标记试剂盒,其标记试剂均由反应基团+平衡基团+报告基团三部分组成,每组试剂盒中的平衡基团+报告基团的质量之和保持一致,而报告基团的大小不同。以TMT标记为例来说明基于iTRAQ或TMT的定量蛋白质组学研究的基本流程。获取样品后,进行蛋白提取和酶解的步骤,得到肽段样品;在肽段水平,用TMT试剂中的不同标记通道来标记各个样品;标记之后的样品等比混合,经过HPLC分成若干组分后,即可进入液质联用系统进行质谱检测和分析。质谱通过报告离子大小的不同可以实现区分不同样品以及对蛋白进行相对定量。


3.2.3靶向蛋白质组学定量技术-平行反应监测(PRM)


小分子定量测定的金标准是基于三重四级杆质谱的MRM(或称SRM)技术,Q1中选择目标离子,Q2中将其打碎,Q3中筛选特定的碎片离子,经过Q1和Q3的母子离子对的双重选择,到达检测器产生检测信号。PRM扫描模式受MRM的启发,在高分辨质谱上实现了针对目标分子的靶向检测。目标肽段母离子在四级杆中进行选择,在碰撞室中进行碎裂,产生的所有碎片离子到达检测器进行扫描得到二级质谱图,数据分析时提取碎片离子的信息进行定量。二级质谱图,数据分析时提取碎片离子的信息进行定量。



3.2.4 蛋白质翻译后修饰定量组学 (Protein translational modifications,PTMs) 

蛋白质翻译后修饰是指功能基团或蛋白质的共价添加、调节亚基的蛋白水解切割或整个蛋白质的降解来增加蛋白质组的功能多样性。这些修饰包括磷酸化、糖基化、泛素化、乙酰化等,这些修饰几乎影响正常细胞生物学和发病机制的所有方面。因此,识别和理解 PTM 在细胞生物学和疾病治疗和预防的研究中至关重要。

(1)蛋白质磷酸化修饰(Phosphorylation)

蛋白质磷酸化,主要发生在丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上,是目前研究得深入的翻译后修饰之一。磷酸化在细胞周期、生长、凋亡和信号转导等过程中起着重要的调控作用。

(2)蛋白质糖基化修饰(Glycosylation)

蛋白质糖基化对蛋白质的折叠、构象、分布、稳定性和活性都有重要影响。以天冬氨酸连接(N-连接)或丝氨酸/苏氨酸连接(O-连接)寡糖形式存在的碳水化合物是许多细胞表面和分泌蛋白的主要结构成分。

(3)蛋白质泛素化修饰(Ubiquitination)

泛素化修饰是一种重要的翻译后修饰。泛素-蛋白酶体系统介导了真核生物体内80%~85%的蛋白质降解。此外,泛素化修饰还可以直接影响蛋白质的活性和定位,调控包括细胞周期、细胞凋亡、转录调控、DNA 损伤修复以及免疫应答等在内的多种细胞活动。

(4)蛋白质乙酰化修饰(acetylation)

顾名思义指的就是在蛋白质原有基础上面嫁接上乙酰化基团,即在乙酰基转移酶(或非酶)的催化下,将乙酰基团转移并添加在蛋白赖氨酸残基或蛋白N端上的过程。乙酰化修饰主要分为两类:蛋白N端的乙酰化修饰和蛋白赖氨酸上的乙酰化修饰。其中赖氨酸乙酰化是通过KAT(赖氨酸乙酰化酶)将乙酰基从乙酰辅酶A转移到赖氨酸的ε-氨基侧链而产生的。赖氨酸乙酰化是一种动态的翻译后修饰过程并且此过程是可逆的,在调控蛋白质功能、染色质结构和基因表达中起重要作用。



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