固话:010-53395839
邮箱:service@qinglianbio.com
网址:www.qinglianbio.com
地址:北京市海淀区永捷南路2号院1号楼 中关村科学城·乡创中心
研究背景
研究重点
研究思路
研究结果
使用非标记定量(LFQ)蛋白质组学分析以全面衡量p97 KD的功能影响,共定量到6,884 种蛋白质。与对照组相比,p97 KD HCT116细胞中鉴定了410种显著上调的蛋白质和356种显著下调的蛋白质(p值<0.05)。 差异分析证实 p97蛋白下调了78%,ATF3和DDIT3 (CHOP)蛋白上调超过10倍(图1A)。这些蛋白质的变化与WB结果一致。通路富集分析发现,三个关键的未折叠蛋白反应(UPR)途径(PERK、ATF6和IRE1a)中富集到的差异蛋白均上调,表明p97缺失激活了所有三个UPR通路(图1B)。此外还发现大多数细胞周期相关蛋白被p97kD下调,包括MCM复合体(图1D)。这一发现与p97 kD细胞较低的增殖率以及p97在DNA复制中的重要作用是一致的。
图1. ShRNA KD抑制HCT116细胞p97抑制的蛋白质组学分析
为了探讨p97抑制的蛋白质组的时间特征,研究人员用二甲基亚砜和p97抑制剂(CB5083、NMS-873和UPCDC-30245)分别处理HCT116细胞2、6、10、18和24 h。从40个样本中共鉴定了7,703个蛋白质。PCA分析显示,6 h和24 h可能是检测p97抑制剂早期和晚期反应的合理时间点。为了比较p97 shRNA KD和不同p97抑制剂的蛋白质组谱,作者比较了p97 kD和不同抑制剂处理下的差异蛋白在各个时间点的差异(p<0.05)。除UPCDC-30245外,重叠的差异蛋白的百分比随着处理时间的延长而增加(图1E)。对这些重叠蛋白的功能富集分析表明,来自CB5083和NMS-873处理的重叠差异蛋白与受p97 KD影响的相同细胞通路有关(图1F)。UPR蛋白和那些与ER中的蛋白质加工相关的蛋白都被CB-5083、NMS-873和p97 KD上调,但不被UPCDC-30245上调(图 1G)。这些数据表明HCT116细胞中CB-5083和NMS-873的MOA与p97 KD相似,但不同于UPCDC-30245的MOA。
蛋白质组学分析揭示了p97和蛋白酶体抑制剂的不同分子机制
为了解p97和蛋白酶体抑制剂在癌症治疗中的不同作用,作者采用TMT标记蛋白质组学比较了p97抑制剂(CB5083和NMS-873)和蛋白酶体抑制剂(MG132)的作用机制。基于之前的结果,选择了6 h和24 h的处理时间点。16个样本中共鉴定到7,942种蛋白,其中6,956种可定量蛋白。作者分析了被p97抑制剂下调而非MG132下调的蛋白质,确定了121种被p97抑制剂特异性下调的蛋白质,这些蛋白质参与p53信号转导、细胞周期、病毒感染和RHO GTPase相关的通路(图 2E)。韦恩图显示了210种被p97抑制剂特异性上调的蛋白质(图 2F),对这些蛋白质的功能富集分析表明,相对于MG132处理,p97抑制剂对ER和UPR中的蛋白质加工有不同的影响。特别是,p97抑制剂在激活IREa和XBP1通路方面表现出更高的效力(图 2G)。总的来说,这些结果表明p97抑制剂影响了不受蛋白酶体抑制剂影响的特定细胞通路。
图3. P97抑制剂和MG132治疗的蛋白质组图谱比较
P97抑制剂通过下调CCND-CDK4/6复合体抑制E2F1介导的转录
数据表明,p97抑制剂导致E2F1转录活性降低,导致E2F1靶基因下调。此外,CCND1的下调发生在ATF3上调之后(图4F)。ATF3是一个应激诱导基因,它与细胞周期蛋白D1启动子结合并抑制其转录。因此,ATF3的上调可能有助于CCND1的下调。此外作者研究了周期蛋白依赖的激酶抑制剂(CKI),发现p21(CDKN1A)可被MG132显著上调,但不能被p97抑制剂上调(图4C和4D)。这表明p21的上调可以阻断MG132处理的细胞中CCND1-CDK4/6复合体活性的增加,并减少RB1的磷酸化。综上所述,结果表明,HCT116细胞对蛋白酶体和p97抑制剂的反应是通过上调ATF3 mRNA和蛋白水平(图4C-4F),导致随后CCND1 mRNA的减少(图4F)。与蛋白酶体抑制增加细胞周期蛋白D1和CDK4/6不同,p97抑制剂的不同之处在于这三种癌蛋白在蛋白质水平上的减少。在p97抑制剂或MG132处理的细胞中,细胞周期蛋白D1和p21都在调节E2F1通路中起着重要作用。总体而言,MG132和p97抑制剂都会导致未磷酸化的RB1减少,从而隔离E2F1并阻止其转录活性。
图4. P97抑制剂通过下调CCND1/CDK复合体抑制E2F1的转录活性
P97抑制剂促进细胞周期癌蛋白下调
功能富集分析表明,细胞周期因子与p97抑制高度相关(图3E)。作者重点研究了差异变化较大的两种蛋白(Cyclin D1和Securin),以研究蛋白酶体和p97抑制剂对蛋白质水平的影响。用p97抑制剂(CB-5083)和蛋白酶体抑制剂(MG132)共同处理细胞。结果表明,MG132处理能在蛋白水平挽救CB-5083介导的Cyclin D1的下调(图5B和5C)。此外,CB-5083和MG132联合作用后,Cyclin D1的表达较单独使用MG132时的降低幅度更大。这一结果表明CB-5083可能促进了HCT116细胞Cyclin D1的降解。作者还检测了胞浆和细胞核中Securin蛋白的降解,发现它被MG132阻断(图5D)。此外,CB-5083和MG132共同处理降低了MG132对Securin的稳定作用(图5D和5E),表明Securin的降解不依赖于p97。当MG132处理细胞1h以增加Securin时,CB-5083对HCT116和HT29细胞中Securin的降解都有轻微的加速作用(图5F和5G)。研究证实Cyclin D1和Securin是蛋白酶体底物,不需要p97就能被蛋白酶体降解。总体而言,p97抑制剂促进了这些细胞周期癌蛋白的下调。这些结果将p97与蛋白酶体在调节细胞周期蛋白中的作用区分开来。
图5. p97促进细胞周期癌蛋白的稳定性
综上所述,抑制p97会损害细胞周期蛋白D1-CDK4/6-INK4-Rb通路和E2F1 的转录活性。这导致细胞周期蛋白的直接下调和细胞周期缺陷。细胞周期缺陷可能进一步放大细胞周期蛋白的下调。因此,该研究提出细胞周期蛋白的下调可能解释了为什么p97抑制剂在实体瘤模型中有效,而稳定细胞周期癌蛋白的蛋白酶体抑制剂在很大程度上是无效的。该结果也为p97在调节许多细胞周期癌蛋白中的关键作用提供了强有力的证据,巩固了其作为细胞周期癌蛋白上调癌症的药物靶标的潜力。
![]() | 固话:010-53395839 |
![]() | 邮箱:service@qinglianbio.com |
![]() | 地址:北京市海淀永捷南路2号院1号楼 中关村科学城·乡创中心 |