使用非标记定量（LFQ）蛋白质组学分析以全面衡量p97 KD的功能影响，共定量到6,884 种蛋白质。与对照组相比，p97 KD HCT116细胞中鉴定了410种显著上调的蛋白质和356种显著下调的蛋白质（p值<0.05）。 差异分析证实 p97蛋白下调了78%，ATF3和DDIT3 (CHOP)蛋白上调超过10倍（图1A）。这些蛋白质的变化与WB结果一致。通路富集分析发现，三个关键的未折叠蛋白反应(UPR)途径（PERK、ATF6和IRE1a）中富集到的差异蛋白均上调，表明p97缺失激活了所有三个UPR通路(图1B)。此外还发现大多数细胞周期相关蛋白被p97kD下调，包括MCM复合体(图1D)。这一发现与p97 kD细胞较低的增殖率以及p97在DNA复制中的重要作用是一致的。

 图1. ShRNA KD抑制HCT116细胞p97抑制的蛋白质组学分析

为了探讨p97抑制的蛋白质组的时间特征，研究人员用二甲基亚砜和p97抑制剂(CB5083、NMS-873和UPCDC-30245)分别处理HCT116细胞2、6、10、18和24 h。从40个样本中共鉴定了7,703个蛋白质。PCA分析显示，6 h和24 h可能是检测p97抑制剂早期和晚期反应的合理时间点。为了比较p97 shRNA KD和不同p97抑制剂的蛋白质组谱，作者比较了p97 kD和不同抑制剂处理下的差异蛋白在各个时间点的差异(p<0.05)。除UPCDC-30245外，重叠的差异蛋白的百分比随着处理时间的延长而增加(图1E)。对这些重叠蛋白的功能富集分析表明，来自CB5083和NMS-873处理的重叠差异蛋白与受p97 KD影响的相同细胞通路有关（图1F）。UPR蛋白和那些与ER中的蛋白质加工相关的蛋白都被CB-5083、NMS-873和p97 KD上调，但不被UPCDC-30245上调（图 1G）。这些数据表明HCT116细胞中CB-5083和NMS-873的MOA与p97 KD相似，但不同于UPCDC-30245的MOA。

蛋白质组学分析揭示了p97和蛋白酶体抑制剂的不同分子机制

为了解p97和蛋白酶体抑制剂在癌症治疗中的不同作用，作者采用TMT标记蛋白质组学比较了p97抑制剂（CB5083和NMS-873）和蛋白酶体抑制剂（MG132）的作用机制。基于之前的结果，选择了6 h和24 h的处理时间点。16个样本中共鉴定到7,942种蛋白，其中6,956种可定量蛋白。作者分析了被p97抑制剂下调而非MG132下调的蛋白质，确定了121种被p97抑制剂特异性下调的蛋白质，这些蛋白质参与p53信号转导、细胞周期、病毒感染和RHO GTPase相关的通路（图 2E）。韦恩图显示了210种被p97抑制剂特异性上调的蛋白质（图 2F），对这些蛋白质的功能富集分析表明，相对于MG132处理，p97抑制剂对ER和UPR中的蛋白质加工有不同的影响。特别是，p97抑制剂在激活IREa和XBP1通路方面表现出更高的效力（图 2G）。总的来说，这些结果表明p97抑制剂影响了不受蛋白酶体抑制剂影响的特定细胞通路。 

图3. P97抑制剂和MG132治疗的蛋白质组图谱比较

P97抑制剂通过下调CCND-CDK4/6复合体抑制E2F1介导的转录

数据表明，p97抑制剂导致E2F1转录活性降低，导致E2F1靶基因下调。此外，CCND1的下调发生在ATF3上调之后(图4F)。ATF3是一个应激诱导基因，它与细胞周期蛋白D1启动子结合并抑制其转录。因此，ATF3的上调可能有助于CCND1的下调。此外作者研究了周期蛋白依赖的激酶抑制剂(CKI)，发现p21(CDKN1A)可被MG132显著上调，但不能被p97抑制剂上调(图4C和4D)。这表明p21的上调可以阻断MG132处理的细胞中CCND1-CDK4/6复合体活性的增加，并减少RB1的磷酸化。综上所述，结果表明，HCT116细胞对蛋白酶体和p97抑制剂的反应是通过上调ATF3 mRNA和蛋白水平(图4C-4F)，导致随后CCND1 mRNA的减少(图4F)。与蛋白酶体抑制增加细胞周期蛋白D1和CDK4/6不同，p97抑制剂的不同之处在于这三种癌蛋白在蛋白质水平上的减少。在p97抑制剂或MG132处理的细胞中，细胞周期蛋白D1和p21都在调节E2F1通路中起着重要作用。总体而言，MG132和p97抑制剂都会导致未磷酸化的RB1减少，从而隔离E2F1并阻止其转录活性。

图4. P97抑制剂通过下调CCND1/CDK复合体抑制E2F1的转录活性

P97抑制剂促进细胞周期癌蛋白下调

功能富集分析表明，细胞周期因子与p97抑制高度相关（图3E）。作者重点研究了差异变化较大的两种蛋白（Cyclin D1和Securin），以研究蛋白酶体和p97抑制剂对蛋白质水平的影响。用p97抑制剂（CB-5083）和蛋白酶体抑制剂（MG132）共同处理细胞。结果表明，MG132处理能在蛋白水平挽救CB-5083介导的Cyclin D1的下调(图5B和5C)。此外，CB-5083和MG132联合作用后，Cyclin D1的表达较单独使用MG132时的降低幅度更大。这一结果表明CB-5083可能促进了HCT116细胞Cyclin D1的降解。作者还检测了胞浆和细胞核中Securin蛋白的降解，发现它被MG132阻断(图5D)。此外，CB-5083和MG132共同处理降低了MG132对Securin的稳定作用(图5D和5E)，表明Securin的降解不依赖于p97。当MG132处理细胞1h以增加Securin时，CB-5083对HCT116和HT29细胞中Securin的降解都有轻微的加速作用(图5F和5G)。研究证实Cyclin D1和Securin是蛋白酶体底物，不需要p97就能被蛋白酶体降解。总体而言，p97抑制剂促进了这些细胞周期癌蛋白的下调。这些结果将p97与蛋白酶体在调节细胞周期蛋白中的作用区分开来。

图5. p97促进细胞周期癌蛋白的稳定性

综上所述，抑制p97会损害细胞周期蛋白D1-CDK4/6-INK4-Rb通路和E2F1 的转录活性。这导致细胞周期蛋白的直接下调和细胞周期缺陷。细胞周期缺陷可能进一步放大细胞周期蛋白的下调。因此，该研究提出细胞周期蛋白的下调可能解释了为什么p97抑制剂在实体瘤模型中有效，而稳定细胞周期癌蛋白的蛋白酶体抑制剂在很大程度上是无效的。该结果也为p97在调节许多细胞周期癌蛋白中的关键作用提供了强有力的证据，巩固了其作为细胞周期癌蛋白上调癌症的药物靶标的潜力。