蛋白质组学

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蛋白质组学,糖基化蛋白质组学,多组学联合分析
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糖基化蛋白质组学——生物标志物研究的良好来源,尿液

2022-08-18 11:50:41

生物标志物是指能被客观测量和评价,反应生理或病理过程,以及对暴露或治疗干预措施产生生物学效应的指标,对于疾病的鉴定、早期诊断及预防、治疗过程中的监控起到帮助作用。糖基化蛋白质组学带你了解生物标志物研究的良好来源,尿液。

体液样本比较好取材,更适合biomarker研究。体液样本中血液是常应用的,血液被认为与机体各器官联系比较紧密,易于接收从各器官分泌的有变化的物质,但其应用于蛋白质组学并不是好的选择。

尿液以各种形式收集血液在稳态机制下排出的废物,汇集了大量的疾病相关变化,能够更好地反映早期微小的变化,是biomarker研究的更好体液来源。接下来介绍两篇应用案例,揭示尿液在biomarker研究中的重要贡献,并提供了典型biomarker研究策略。

案例一

2022年05月19日,中国医学科学院北京协和医学院分子肿瘤学重要点实验室孙玉琳团队,联合中国医学科学院北京协和医学院基础医学研究所孙伟团队在国际知名期刊Nature Communications上联合发表了题为“Noninvasive urinary protein signatures associated with colorectal cancer diagnosis and metastasis”的研究论文。该研究利用尿液蛋白质组学技术在大规模队列中发现了可用于诊断和转移风险预测的标志物组合,研究产生了高度准确的无创尿蛋白特征,并将改善尿蛋白质组学在未来结直肠癌(CRC)研究中的应用。



糖基化蛋白质组学



研究背景

结直肠癌(CRC)是全球第三大常见的恶性肿瘤,也是癌症死亡的二大原因。CRC的临床诊断主要由区域淋巴结转移(LNM)和远处转移(DM)定义,LNM和DM也是与CRC患者生存和复发直接相关的预后因素。目前临床上基于影像学的单一监测策略不足以评估转移和复发,在临床上仍然迫切需要更准确和无创的生物标志物。尿液是发现早期和敏感生物标志物的来源,因为它可以迅速反映身体的变化。因此,尿液是生物标志物分析的良好样本。

样本选择

共选用552例尿液样本;其中健康组(HC)289例,无转移瘤(NM)、淋巴结转移(LNM)和远处转移(DM)的CRC患者共263例。

技术策略

TMT蛋白质组学、PRM蛋白质组学、定量点印迹分析、IHC分析

研究思路




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研究结果

基于TMT定量蛋白质组学在四组中分别鉴定出2291,2642,3363和3181蛋白质。对4组995种常见蛋白进行无监督主成分分析(PCA),观察HC与CRC不同分期患者之间的尿蛋白谱差异。结果表明HC和CRC组之间存在明显差异(图2a)。NM、LNM或DM和HC之间的成对差异尿蛋白采用平均倍数变化≥1.5的标准进行定义,分别鉴定出273、337和355个差异蛋白。IPA分析发现这些差异蛋白在肿瘤相关通路中显著富集,包括肿瘤生长、肿瘤侵袭、免疫反应、代谢和信号传导(RAC、FAK、CDC42和RhoA)途径(图2b-f)。



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 图1. 发现阶段CRC的定量尿蛋白质组学分析



随后研究人员采用靶向高通量蛋白质组学技术PRM来验证差异尿蛋白。在发现阶段鉴定的CRC相关和CRC转移相关差异蛋白中,分别选择了112和54种差异蛋白进行PRM验证。其中41种差异蛋白其趋势与TMT方法一致,包括18种下调和23种上调蛋白。接下来选择14种相互依赖性较低的蛋白进行随机森林分析确定诊断模型和转移模型中重要的特征(图3b)。同时使用ROC分析检测每种蛋白质在诊断和转移风险分层中的分类性能(图3c)。建立了用于CRC诊断的尿蛋白标志物组合(CORO1C,ARPC5和RAD23B),以及用于CRC转移风险预测的标志物组合(CORO1C,RAD23B,GSPT2和NDN)。



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图2. CRC尿蛋白生物标志物特征生成



为了验证尿液特征以大规模区分HC和CRC患者,研究人员开发了一种基于尿液的定量点印迹检测系统。通过每种蛋白质的标准曲线量化尿蛋白量,然后通过相应的尿肌酐测量值进行校准。进一步在434份尿液样本中进行免疫学验证,发现CRC患者尿液中CORO1C,ARPC5,RAD23B,GSPT2和NDN的浓度显着高于HC的尿液(P <0.0001)。在三个CRC组中,这五种尿液蛋白的水平显示出与疾病进展相关的梯度增加的趋势,且在DM达到高水平(P<0.01)。

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 图3. 使用点印迹分析独立验证尿液蛋白特征



为了评估尿液中三种诊断相关蛋白(CORO1C、RAD23B和ARPC5)的异常改变是否来自CRC肿瘤组织,研究人员在几个组织微阵列中进行了免疫组织化学染色测定。CORO1C和ARPC5定位于细胞质中,而RAD23B主要定位于细胞质和细胞核中。CRC肿瘤组织的CORO1C、RAD23B和ARPC5免疫染色阳性,与邻近的非癌组织(所有P<0.0001)相比,表现出显著上调。Kaplan–Meier生存分析表明,CORO1C和RAD23B在诊断和转移特征上是共同的,高水平的CORO1C和RAD23B组织表达促进大肠癌中恶性细胞的转移潜能,且与不良预后显著相关。然而ARPC5在大肠癌中没有预后意义。



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图4. 组织中三种诊断生物标志物的免疫组织化学染色及生存分析



小结

该研究利用尿液蛋白质组学方法,并结合discovery-verifification-validation的标志物研究策略,系统地分析了用于CRC诊断和预后的尿蛋白。该研究是目前为止在CRC中规模大、多方面的尿液生物标志物发现研究。尿液蛋白质组可以多方面反映不同CRC阶段的病理生理变化,即使在CRC早期也是如此。该研究结果提供了有希望的尿蛋白生物标志物,可以可靠地诊断和检测CRC,同时也表明了转移性CRC的潜在介入靶点。由于只有少数早期CRC患者入组,因此需要进一步验证检测一等级CRC的诊断模型的准确性。还需要使用更大的队列进行外部验证,以概括结论。

案例二

2022年6月22日,北京师范大学高友鹤教授团队在蛋白质组学期刊Clin Proteomics上在线发表了题为“Many kinds of oxidized proteins are present more in the urine of the elderly”的研究论文。该研究利用尿液蛋白质组学技术,表明了氧化蛋白存在于尿液中,并且老年人的氧化率高于年轻人。揭示了提高氧化蛋白在体内通过肾脏的排泄程度可能有助于维持身体内部环境的稳态,延缓衰老和老年性疾病的发生。






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研究背景

近一个世纪以来,科学家们一直在不断探索衰老的奥秘,并试图找到减缓衰老的方法。一些研究发现,氧化应激会加剧衰老和与年龄相关的疾病。因此,防止氧化应激是介导长寿动物模型中观察表型的常见手段。而尿液为许多疾病提供了另一种有前途的临床可行基质,因为它可以频繁且无创地大量收集,特别是提供诊断和预后机会。然而,只有少数PTM被应用于尿液生物标志物研究。该研究探索了尿蛋白修饰与衰老之间的关系。

样本选择

共收集38名健康个体的尿液样本;其中包括儿童22例和老年人6例(RAW数据从已发表的研究下载),以及年轻组10例

技术策略

LFQ蛋白质组学(搜索不同修饰)

研究思路




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研究结果

基于非标记定量蛋白质组学方法,在38个样本中共鉴定出1480个修饰,这些修饰发生在蛋白质链中的20个氨基酸以及N和C末端。量化的修饰强度跨越了七个数量级,其中前十个丰富的蛋白质贡献了整个修饰强度的百分之81-91(图1c)。图1d显示了3个不同年龄的已识别修饰数,并且儿童、年轻和老年阶段有变化的修饰之间的重叠是显著的(图1e,pvalue<0.05,FC>2或<0.5)。主成分分析显示出不同年龄组的有效分离(图1f-g)。此外根据每个年龄组每种修饰的比值(修饰位点数/肽段数)计算了不同氨基酸修饰的比例。结果发现,在脯氨酸(Pro,P)、色氨酸(Trp,W)、酪氨酸(Tyr,Y)、半胱氨酸(Cys,C)、亮氨酸(Leu,L)、苯丙氨酸(Phe,F)、缬氨酸(Val,V)和异亮氨酸(Ile,I)的非人工修饰中,氧化和氨基酸取代占主要地位,特别是在脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和异亮氨酸中,老年组的氧化速率高于其他年龄组(图1h)。



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 图1. 尿蛋白质组学中化学修饰的发现队列总述



为了大限度地减少Open-search带来的假阳性结果,对于所获得的显著表达的氧化修饰和AA取代,通过重复搜索识别进一步检查这些修饰的真实性。通过计算发现11种氧化修饰和3种AA取代的表达随年龄增长而显著增加(图2g)采用Wilcoxon秩和检验建立单个标志物的统计显著性,并评价整个ROC曲线的显著性。其中,4个氧化和1个AA取代的AUC>0.99(图2j)。



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 图2. 发现队列中的氧化和AA取代随年龄的变化



为了验证不同年龄组的氧化修饰,作者接下来收集了来自21-72岁个体的28个样本,以重复上述实验过程。在年轻、中年和老年组中存在7种差异表达的氧化,它们是潜在的衰老诊断标志物(图3d)。7种差异表达的氧化所属的蛋白中,骨桥蛋白(基因SPP1)的氧化位点在所有氧化蛋白中高。此外,作者还在喂养了27天、240天和600天7只雄性大鼠的尿液样本中进一步验证该结果。所有氧化修饰的无监督聚类分析显示,老年大鼠可以和年轻和成年阶段显着区分开来。与其他组相比,老年大鼠的8种氧化差异,随着年龄的增长几乎呈线性增加(图3e)。



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图3. 验证队列进行开放和重新搜索



小结

该研究发现一些修饰在老年人中高于年轻人,其中氧化占很大比例。这些修饰的蛋白质可能由于结构变化而从体内排出,导致功能丧失甚至对身体有害的影响。代谢或减少这些蛋白质的积累对于维持体内稳态甚至延缓衰老和衰老相关疾病可能具有重要意义。


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