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北京多组学联合分析——纵向队列蛋白组学发现急性高原病临床生物标志物

2022-07-11 11:20:21

北京多组学联合分析



北京多组学联合分析机构带你了解纵向队列蛋白组学发现急性高原病临床生物标志物

文章标题:Proteomic and clinical biomarkers for acute mountain sickness in a longitudinal cohort

发表期刊:Communications Biology(IF6.548)

发表时间:2022年6月

研究背景

急性高原病(AMS)是常见的高原病之一,也是研究环境适应能力的经典模型之一。AMS的诊断依赖于问卷调查形式,并受多种不可控因素的影响。而AMS的发病机制尚不清楚,不能完全通过病理生理过程描述AMS,因此需要探索可靠的AMS生物标志物。

研究内容

对53名前瞻性队列的汉族个体血浆样本进行OLINK蛋白质组学检测和MRM验证(验证阶段由青莲百奥生物科技有限公司提供),通过差异分析、机器学习和功能关联分析,发现并证实RET在AMS的发病机制中起着重要作用。基于XGBoost模型的高准确度(AUCs>0.9),将ADAM15、PHGDH和TRAF2分别作为保护性、预测性和诊断性生物标志物,为深入探讨AMS疾病的致病机制,进一步理解平原人群对高海拔环境的适应性提供了一定的依据。

研究思路

olink+质谱法的MRM结合是发现验证疾病biomarker的重要手段。




北京多组学联合分析



结果速递

01基于PEA的发现阶段和AMS相关蛋白质的鉴定

在发现阶段,测量了10个AMS包括1k和4k中受试者中的1069个蛋白质,基于q值<0.05,确定了47种差异表达蛋白(DEP),其中包括40种上调蛋白和7种下调蛋白,差异蛋白可以清楚区分AMS1k和AMS4k组,通过对上调和下调蛋白进行GO功能富集分析,发现能量代谢途径,如氮代谢、戊糖磷酸途径和糖酵解/糖异生,在Cluster2中显著下调,而在Cluster1中,细胞因子-细胞因子受体相互作用和TNF信号途径显著上调 。总的来说,参与细胞因子-细胞因子受体相互作用途径的三种细胞因子,即IL6受体家族(LEPR)、IL-1受体家族(IL18R1)和TGF-β家族(GDF15及INHBC)均上调。这些发现表明,免疫和炎症反应以及能量代谢参与了AMS的发病机制。




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02通过多反应监测MRM进行验证

为了证实PEA鉴定的DEPs和AMS之间的关联,使用MRM技术分析了53名中国汉族男性受试者53对血浆样本(30个AMS4k、30个AMS1k、23个nAMS4k和23个nAMS1k)中的102种蛋白质(添加55种参与磷酸戊糖和糖酵解途径多种途径的蛋白质,将47种蛋白质扩展到102种蛋白质)。

2.1参与AMS发病机制的关键蛋白

AMS4k和AMS1k组47种蛋白质中有23种(百分之49)呈现出与PEA鉴定的DEPs一致的变化趋势。在这些蛋白质中matrilin 3 (MATN3)、myocilin (MYOC)、ret protooncogene(RET)和S100 calcium binding protein A12 (S100A12) 存在显著差异,MYOC参与细胞骨架功能,MATN3促进HIF-1α途径中的主要因子HIF-1α31的表达,以应对缺氧和炎症,S100A12是一种钙、锌和铜结合蛋白,在炎症过程和免疫反应的调节中发挥重要作用,这验证了它们可能参与对AMS的反应。值得注意的是,RET在nAMS4k和nAMS1k之间显示出相反的变化趋势,尽管这种差异在统计学上并不显著。此外,经MRM鉴定的DEPs富集到了HIF-1信号通路、糖酵解/糖异生和碳代谢等信号通路。

2.2参与AMS发病机制的保护蛋白

nAMS4k组和nAMS1k组之间的比较可用于探索保护相关蛋白。nAMS4k和nAMS1k组之间发现29个保护性DEPs。总的来说,这两组之间ADAM metallopeptidase domain 15 (ADAM15)、CD38 molecule (CD38)、cystatin E/M(CST6)、KIT ligand (KITLG)、thrombomodulin (THBD)趋势与AMS4k和AMS1k组之间趋势相反,这表明它们在预防AMS和快速适应高海拔环境方面具有潜在的保护作用。其中,ADAM15下调表达程度大。

2.3AMS的预测性生物标志物

AMS1k和nAMS1k组之间的比较可以识别预警生物标志物。在AMS1k和nAMS1k组之间确定了23个DEPs,其中17个DEPs显示出与AMS4k和nAMS4k组之间获得相同的趋势,显示了这些蛋白质的稳定性。基于log2FC的值大于0.5的筛选得到6种上调蛋白:phosphoenolpyruvate carbox-ykinase 1 (PCK1)、phosphoglycerate dehydrogenase (PHGDH)、ribokinase (RBKS)、S100A12、solute carrier family 4 member 1(SLC4A1)、secreted protein acidic and cysteine rich (SPARC)。在这些DEPs中,PCK137和RBKS参与碳水化合物的代谢。这些结果表明,这些蛋白是AMS的候选预警生物标志物。

2.4AMS诊断生物标志物

AMS4k和nAMS4k组之间的比较可用于发现AMS的诊断生物标志物。两组比较发现28个DEPs。基于log2FC值进行过滤后,10种上调蛋白(ARF6、EBI3、ISLR2、MYOC、NRP2、RBKS、RET、TRAF2、WAP、WFIKKN1)等仍然存在。在这些蛋白质中,EBI3、RET和WFIKN1与AMS1k和nAMS1k组之间的比较结果显示出相反的调节趋势,这表明它们更可能成为诊断生物标记物。值得注意的是,RET在AMS4k组和AMS1k组之间表现出相同的调节趋势,表明其在AMS发病机制中起着作用。



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03机器学习进行AMS分类表征

XGBoost机器学习模型在区分AMS4k和AMS1k、nAMS4k和nAMS1k、AMS4k和nAMS4k以及AMS1k和nAMS1k方面表现出良好的性能。本研究使用了10倍交叉验证和MRM鉴定的DEPs来增强模型的稳健性和性能。

区分AMS1k和AMS4k组的发病机制模型中,筛选出7种重要蛋白质(RET、ISLR2、MATN3、SCARA5、CA2、MYOC和S100A12),模型的曲线下面积(AUC)为0.90。值得注意的是,根据差异丰度分析,RET、MYOC、MATN3和S100A12也是候选的发病相关蛋白。

区分nAMS1k和nAMS4k的保护模型中,筛选得出5种重要蛋白质(ISLR2、MYOC、WFIKN1、SCARA5和ADAM15),模型的AUC为0.95,这表明这些蛋白质可能参与在高海拔地区减轻无AMS个体的AMS症状。其中,ADAM15在差异丰度分析中被认定为一种重要的候选保护蛋白。因此,ADAM15可以作为预防和治疗AMS的候选靶点。

区分AMS1k和nAMS1k的预警模型中筛选得出8种重要蛋白质(PHGDH、UBA1、RBK、GNA13、IGFBP7、FCN2、CA2、V-set和VSIG4),模型的AUC为0.91(p值=0.001)。通过差异丰度分析,PHGDH和RBK也被确定为潜在的预警生物标志物,用于评估个体在上升到高海拔之后,AMS的发生情况。尤其是参与葡萄糖/能量代谢的PHGDH,其重量是模型中其他蛋白质的四倍。

区分AMS4k和nAMS4k的诊断模型中筛选出13种重要蛋白质(TRAF2、AGT、IL18R1、THY1、ISLR2、TCN2、CD38、GNA14、INHBC、GC、RBKS、WFIKN1和ARF6),模型的AUC为0.89,这表明这些蛋白质具有作为AMS诊断生物标志物的潜在价值。通过差异分析,TRAF2、GC和WFIKN1也被确定为候选诊断生物标志物。

综上,此研究建立了稳健的机器学习模型,很好地区分了这些比较组,并提供了四组候选生物标志物。



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04AMS的关键临床指标

利用差异临床指标,构建机器学习模型,以区分AMS4k与AMS1k、nAMS4k与nAMS1k、AMS4k与nAMS4k以及AMS1k与nAMS1k。在区分AMS1k和AMS4k的发病机制模型中,有19个临床指标(如如A-TPO、C-peptide、phosphate、E2、CKMB和thyroxine)分类准确率非常高(AUC=0.96,p值<0.0001)。保护模型中用16项临床指标(FT3、ferritin、free Prostate-specific antigen (FPSA)、creatinine、C3C和 FSH)区分nAMS1k和nAMS4k,AUC为0.94(p值<0.001)。预警和诊断模型分别筛选得到3个临床指标(proBNP、BILT和 thyrotropin)和4个临床指标(procalcitonin、TP1NP、C-peptide和insulin),AUC分别为0.67和0.7(p值>0.05)。临床指标在预测和诊断AMS方面的表现似乎不如蛋白质。

在预测和诊断模型中,单独使用蛋白质和组合数据获得的分类性能相似。值得注意的是,与使用组合数据获得的预警模型相比,单独使用蛋白质获得的预警模型中保留的特征更少。此外,利用组合数据获得的诊断模型中,所有重要特征都是蛋白质。因此,在预测和诊断AMS时,蛋白质是比临床指标更好的选择。



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05AMS个体间碳水化合物代谢相关蛋白的变化

在低海拔地区,患AMS的个体比未患AMS的个体对糖异生的利用率更高。糖异生的两个关键酶G6PC和PCK1在AMS1k组中的丰度高于nAMS1k组。在高海拔地区,患有AMS的个体可能比未患AMS的个体表现出更高的糖酵解利用率,研究发现AMS4k中的PFKM是糖酵解的关键限速酶,其水平高于nAMS4k,这将导致产生更多的1,6-二磷酸果糖,从而刺激糖酵解。其次,AMS个体乳酸脱氢酶A(LDHA)和ALDOA水平高于未患AMS个体,二者参与糖酵解和糖异生,糖异生相关酶PCK1和G6PC在AMS4k和未患AMS4k之间表现出相似的表达水平。因此,推测AMS4k组的糖酵解而非糖异生比nAMS4k组更活跃。

在低海拔和高海拔地区,患有AMS的个体可能比未患AMS的个体具有更活跃的TCA循环。尽管在两组个体中,在上升到高海拔后都发现TCA循环受到克制,但PDHA1在患有AMS的个体中的水平仍然高于未患AMS的个体。

患有AMS的个体在低海拔地区可能表现出更强的糖异生能力,在高海拔地区的糖原利用率和糖酵解率可能高于未患有AMS的个体。在上升到高海拔后,所有个体的TCA循环都受到克制,而患有AMS的个体的TCA循环比未患有AMS的个体更活跃。

综上,不同的碳水化合物代谢途径在适应高海拔环境中起着关键作用。



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06蛋白质、临床指标和AMS症状表型之间的关联

对53名低海拔或高海拔人群的临床指标、蛋白质和AMS症状表型之间的相关性分析表明,有助于了解AMS的致病机理、预警或诊断。未发现AMS1k和nAMS1k之间的差异特征与AMS症状表型相关。然而,在AMS1k和nAMS1k之间发现促甲状腺素与葡萄糖/能量代谢相关蛋白PCK1、PHGDH和IGFBP7之间存在联系。促甲状腺素和PLA2G7的单核苷酸多态性分别与血压变化和高血压相关。此外,在AMS4k组和nAMS4k组之间,包括FGF23、RET、IL18R1和GNA14在内的蛋白质与AMS症状表型(如食欲不佳、呼吸困难和唇发绀)呈正相关,而非临床指标。此外,C-peptide与13种蛋白质呈正相关,例如候选致病相关蛋白MYOC(ρ=0.42,q值<0.05)、KITLG(ρ=0.27,q值<0.05)和诊断生物标记物TRAF2(ρ=0.36,q值<0.05)。因此,C-peptide可能参与AMS的发病机制,而我们研究的临床指标在预测和诊断AMS方面的表现并不优于蛋白质。




北京多组学联合分析



使用Olink的PEA技术分析了10名低海拔和高海拔AMS患者的1069种蛋白质,并鉴定了47种AMS相关蛋白质。使用基于MS的MRM技术,在53名有或无AMS的低海拔和高海拔个体中验证了102种蛋白质。PEA和MRM的结合可以在很大程度上避免假阳性,提高候选生物标志物的质量。系统地分析了可能参与AMS发病机制、保护、预测和诊断的蛋白质和临床指标,以确定候选治疗靶点和生物标志物。分析了同一队列中的22个AMS症状表型和65个临床指标,并确定了AMS相关蛋白、表型和临床指标之间的强相关性,这为使用蛋白质和临床指标准确重新定义AMS提供了基础。


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