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蛋白质组学,糖基化蛋白质组学,多组学联合分析
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糖基化蛋白质组学——大队列人体尿液样本中O-糖基化蛋白组学分析

2022-06-27 11:33:24

蛋白质科学机构( 北京)、中国军事科学院军事医学研究院生命组学研究所钱小红团队、秦伟捷团队合作,在专业学术期刊Analytical Chemistry上发表了一种大规模尿液样本的O-糖基化组学分析新策略,可快速识别、高深度和可重现性的无标记的人类尿液O-糖基化定量蛋白质。这种策略将数据库搜索速度提高了20倍,并使单个样品中完整O-糖肽定量提高了百分之30-40,重现性明显提高。运用该集成数据处理策略,作者共在36个健康的人类尿液样本中鉴定出1300个完整的O-糖肽,对应于435个O-糖蛋白,缺失数据量减少了百分之30-40,这是目前尿O-糖蛋白组学的大数据集,证明了这种新策略在大规模临床研究中的应用潜力。




糖基化蛋白质组学



长期以来,蛋白质O-糖基化一直被认为是与许多疾病密切相关,特别是与肿瘤的增殖、侵袭和转移有关。有效地描述O-糖基化的变化为癌症诊断生物标志物的开发提供了重要的途径。然而,由于蛋白质组中丝氨酸和苏氨酸残基的广泛存在以及以及数十种不同的O-聚糖类型导致糖基化数据库的搜索时间非常长,这是大型临床队列O-糖蛋白组学研究的主要障碍。更重要的是,由于完整的O-糖肽的丰度低且离子化差,并且依赖于数据的MS2采集具有随机性,因此随着样品数量的增加,不可避免地会缺少大量数据,这破坏了样品之间的定量比较。这些都是目前大型临床人群O-糖蛋白组学研究面临的挑战。



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图一:糖基化实验方案分析流程



1集成数据库处理策略使搜库时间减少20倍

首先对HILIC富集的O-糖肽进行MS分析得到的谱图筛选出具有特征的糖链碎裂离子,以过滤候选O-糖肽谱图。根据是否存在唾液酸片段,将提取的谱图分为两组,并使用相应的含唾液酸(SA)或非唾液酸(non-SA)聚糖数据库搜索质谱图,可以显著减少完整O-糖肽的搜索时间。通过筛选HexNAc的常见诊断碎片离子,从原始数据文件中首先对完整的O-糖肽谱图进行分类,然后根据特征的存在/不存在,将其进一步分为SA和非SA亚组。使用Byonic软件的内置聚糖数据库中的70个聚糖被分为SA(27种糖形式)和非SA(43种糖形式)聚糖数据库。以这种方式,仅针对聚糖数据库中的相应亚组搜索完整O-糖肽的每个谱图亚组。




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图二:使用不同策略的数据库搜索时间



作为概念证明,作者使用了包含26313、26713和24776个谱图的原始MS文件作为模型样本。对于完整的O-糖肽搜索,Byonic软件的聚糖数据库中的每个糖型均被视为MS2谱图数据库搜索的可变修饰。 如图二所示,仅将O-糖肽谱图进行分类就可以将搜索时间减少一半。 但是,将谱图分为SA组和非SA组并搜索由特定糖型组成的相应聚糖数据库后,搜索时间减少了20倍。数据库搜索所需的时间从> 120 h(使用所有MS2质谱图)减少到60 h(使用O-糖肽谱图),使用作者针对糖型的特定策略进行数据库搜索的时间减少到6 h。明显减少了数据库搜索时间。

2通过匹配参考库,缺失值降低百分之30以上

对于尿液O-糖蛋白组的定量研究,由于完整的O-糖肽的丰度低且离子化差,对36个尿液样品进行基于DDA的MS2采集会导致定量重现性较差,初始缺失值为百分之65.5。为了解决此问题,作者使用已鉴定的O-糖肽数据集的MS1功能和MS2谱图建立了参考库。经过特征匹配,谱图传播和后处理质量控制后,成功地估算了几乎一半的缺失值(图三),以促进不同尿液样本之间的大规模定量比较。在插补后,缺失值从百分之65.6降低到百分之34.1,获得更多方面和可靠的尿液O-糖蛋白组动态范围,这可以有效促进不同尿液样本之间的大规模定量比较。



糖基化蛋白质组学

图三:(a)36个人类尿液样本中丢失的数据(显示为空白)和MS2鉴定的O-糖肽(显示为蓝色)的分布。(b)O-糖肽的估算缺失数据(红色显示)的分布。

总结

在这项工作中,作者开发了一种集成的MS数据处理策略,其中包括特定于糖型的数据库搜索,基于参考库的MS1特征匹配和MS2标识传播。此策略将数据库搜索速度提高了20倍,并使单个样品中完整O-糖肽定量提高了30%-40%,重现性明显提高。作者共在36个健康的人类尿液样本中鉴定出1300个完整的O-糖肽,对应于435个O-糖蛋白,证明了这种新策略在大规模临床研究中的应用潜力。

糖基化蛋白质组学是一种常见的蛋白翻译后修饰,是在糖基转移酶作用下将糖类转移至蛋白质和蛋白质上特殊的氨基酸残基形成糖苷键的过程。糖基化类型主要可分为两种N-糖基化和O-糖基化。青莲百奥在糖基化修饰检测方面经验丰富,有着专业分析软件和糖基化分析数据库,拥有强大的质谱平台,专业的科研服务精神,为您在该研究方向提供专业的服务。


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