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蛋白质组学,糖基化蛋白质组学,多组学联合分析
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北京多组学联合分析之—转录组+代谢组

2022-06-20 13:52:31

转录组是研究功能基因的利器,通过转录组测序可以得到大量差异基因和众多调控网络,围绕转录组开展的多组学分析策略已是多种类型高分文章的“法宝”。代谢组学是继基因组学、转录组学、蛋白质组学后出现的新兴“组学”,是生物体表型的基础和直接体现者,研究的是生物体被扰动后其代谢产物的种类、数量及其变化规律的科学。

1. 为什么要进行转录组+代谢组关联分析?

生物过程具有复杂性和整体性,单一组学的数据难以系统多方面地解析复杂生理过程的调控机制。多组学联合分析可以共同探究生物体内潜在的调控网络机制,为生物体作用机制提供了更多证据。转录组+代谢组关联分析可以同时实现从“因”和“果”两个层面来探究生物学问题,相互间进行验证,从海量的数据中筛选出关键基因、代谢物及代谢通路,深度解析生物系统的宏观发育过程,解释生物过程的复杂性和整体性。当前已成为多组学研究中成熟,深入,发文多的技术。

2. 转录组+代谢组关联分析如何进行样本准备?

转录组+代谢组联合分析为一份样本同时送测两个组学,多组学联合分析在样本量的准备上会有更高的要求。普通转录组推荐准备三个生物学重复,而由于代谢组学是基于多元统计分析方法进行的,在样品准备上相对于转录组而言需要更多的重复数据,推荐单样本至少有六个生物学重复。生物学重复不仅能够消除组内误差、作为实验设计质控点用于判断实验设计过程是否异常、检测离群样本有效规避实验失败的风险,更重要的是可以增强结果的可靠性,尤其对于临床项目,研究对象有着复杂的遗传背景、生活方式、个体年龄性别体质等等,导致难以实现背景一致性的样本,所以更要通过设置生物学重复来降低样本间背景差异所造成的影响。      



北京多组学联合分析



3. 如何进行转录组+代谢组联合分析?

转录组与代谢组联合分析是基于两个组学各自的标准分析结果,将差异基因和差异代谢物在代谢通路上的注释结果进行关联分析,可以在代谢通路上更好地解释转录调控机制。基于KEGG功能通路和基于表达量数据的关联分析是当前转录组+代谢组常用的两种分析策略。

1)基于KEGG功能通路的关联分析策略

参与同一生物过程中的基因或代谢物具有相同/相似的变化规律。以相同生物学意义为基础,通过代谢组分析获得重要差异代谢物或重要代谢通路,联合转录组数据鉴定出重要代谢通路上发生变化的目标基因。或从转录组数据入手,通过差异分析获取大量差异基因,再结合代谢组数据,快速鉴定代谢相关的差异功能基因。

2)基于表达量数据的关联策略

当没有目标通路时或富集结果不理想时,我们可以根据差异代谢物和差异基因表达量进行相关性分析,获取潜在调控机制。相比于基因通路的关联策略,基于表达量的分析策略包括:①根据差异代谢物和差异基因表达量,利用斯皮尔曼算法对差异的基因和代谢物进行相关性聚类热图分析,或对相关系数设定阈值,对相关性强的关系对,绘制相关性网络图;②利用显著差异的代谢物和基因,分别构建O2PLS-DA模型。通过该分析,可以知道两组学数据是否有共同决定模型差异的趋势以及找出那些决定模型差异趋势有关联关系的变量。

总之,对于转录组+代谢组联合分析,我们有三个思路:①做完两个组学之后,联合分析讨论;②转录和代谢相互验证;③两个组学联合锁定到具体的点,然后针对这个点做后期验证。



北京多组学联合分析



4. 候选基因常见的实验验证策略有哪些?

1)基因表达量的验证:候选基因表达量的验证,目的是确定该基因在特定组织(细胞)中的表达量与对照组织(细胞)有差异。如实时荧光定量PCR(提取总RNA、检测、反转录成cDNA—引物设计—PCR扩增、收集荧光信号—计算相对/表达量)、Northern blot (提取总RNA—琼脂糖凝胶电泳—转膜、紫外交联—制备探针—探针杂交—曝光)。

2)基因位置定位:亚细胞定位是指某种蛋白或某个基因表达产物在细胞内的具体存在部位,如在胞核、胞浆内、细胞膜或某一特定细胞器上存在。生物信息学预测法、免疫荧光法、GFP融合蛋白表达法是常见的亚细胞定位方法。免疫荧光法是将免疫学方法与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出,从而可对抗原进行细胞定位。GFP融合蛋白表达法,GFP是一种由水母体内发现的发光蛋白,由238个氨基酸构成,其在扫描共聚焦显微镜的激光照射下会发出绿色荧光,从而可以准确地定位蛋白质的位置。GFP融合蛋白表达实验流程:亚细胞定位预测软件分析—植物过表达载体构建—将目的基因克隆至过表达质粒—转化至农杆菌中—农杆菌浸染烟草或水稻—亚细胞定位—激光共聚焦扫描。

3)候选基因功能验证:将基因进行敲除(敲低)、过表达,或进行功能回复实验,确定该基因的差异表达与生理或病理状态相关。基因过表达验证,过表达就是把基因上调表达,即该基因被过度的转录、翻译,终基因表达产物超过正常水平。验证流程:选取目的基因—基因表达载体的构建—将目的基因导入载体—载体浸染细胞或愈伤组织—目的基因的检测和表达—细胞或个体生物学水平的鉴定。基因功能缺失研究,如RNA干扰技术和CRISPR-Cas系统。

4)互作验证:研究 RNA与RNA或RNA与蛋白之间如何作用、调控,导致功能改变。包括双荧光素报告酶系统检测、免疫沉淀(IP)、 凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)和RNA荧光原位杂交(RNA-FISH)等。


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