蛋白质组学

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蛋白质组学,糖基化蛋白质组学,多组学联合分析
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北京蛋白质组学——蛋白质组学FAQ→蛋白产品相关问题(四)

2022-05-20 14:25:53

蛋白质组学(英语:proteomics,又译作蛋白质体学),是以蛋白质组为研究对象,研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学。这个概念早是在1994年,由Marc Wikins首先提出的新名词。

上次分享了蛋白产品相关问题(三),本周二北京蛋白质组学将分享蛋白产品相关问题(四)~

现在小编将带您进入今日主题

16. 通过 iTRAQ/TMT 实验筛选到的差异蛋白,如何挑选验证?

答案:大规模的组学数据需要后期具体的验证实验,以支持组学数据和结论的可信度、说服力,也可以进一步提供文章发表的档次。可以从如下几个方面进行选择:

a) 研究相关的文献报道,已知与该研究课题密切相关的蛋白质进行进一步的研究;

b) 优先挑选蛋白质组学定量差异倍数较大的蛋白进行研究;

c) 挑选鉴定到的差异蛋白中unique peptide 数量相对多的蛋白进行研究(unique peptide 数量越多,可信度越高)、

d) 挑选组间平行性好的,表达趋势一致的蛋白进行进一步研究(趋势越一致,说明蛋白变化越可信)



北京蛋白质组学



e) 结合功能分析或通路分析(生物信息学的分析范畴),筛选得到的有意义的蛋白进行研究

17. 通过iTRAQ/TMT 实验筛选到的差异蛋白,如何进行进一步的验证?

答案:验证方法很多,如Western blot、ELISA 、PRM(平行反应监测),该方法是基于靶向的蛋白质组学,研究特定蛋白的表达变化。也可以用代谢组学,基因组学等多组学互相验证。

18. 通过 iTRAQ/TMT 实验筛选到的差异蛋白,为什么后续验证不出来?

答案:可以从以下几个方面考虑:

A、选择验证的目标是否合理, 实验是否具有重复性和可靠性;

B、蛋白修饰水平的验证是否具有时效性;

不同阶段如基因水平到蛋白质水平的验证可能会有表达差异;大规模数据的筛选会存在一定的假阳性。

19. 为什么通过 Elisa、WB 能检测到的蛋白在 iTRAQ/TMT 或蛋白鉴定实验中没有检测到?

答案:western blot检测是将目的蛋白质信号放大很多级之后进行检测的,灵敏度很高,(除非特异性结合之外)专一性强,特异性检测目标蛋白,几乎不受复杂样品中背景蛋白质丰度的影响。对于纯蛋白质样品,质谱检测的灵敏度达fmol 水平。但在复杂样品中,质谱不是专一性检测的,而是选择样品中丰度较高的蛋白质优先检测,而丰度较低的蛋白质则因为肽段信号过弱被淹没而不能被检测到。因此,如果样品中待检测的目标蛋白质丰度较低(或者蛋白质分子量较小),即使 WB 能够检测到,质谱并不一定能检测到。

20. 为什么DIA无需进行高丰度去除、无需分级?

答案:DIA是一种全扫描技术,是将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口,高速、循环地对每个窗口中所有离子进行选择、碎裂及检测,从而无遗漏、无差异地获得样本中所有离子的全部碎片信息。因此DIA在获得更高覆盖度信息的前提下,还尽可能减少高丰度蛋白对质谱扫描的影响。


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