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北京糖基化蛋白质组学—— 糖蛋白的鉴定

2022-04-22 14:29:58

北京糖基化蛋白质组学机构带你了解糖蛋白的鉴定。

由于糖链的复杂性,很难通过单一的方法进行序列测定等研究,需要多种方法组合完成。

2.1 糖蛋白的富集方法

2.1.1 凝集素亲和技术 此法主要根据凝集素能特异性识别并结合一类或几类特异糖基这一性质,然后对糖蛋白进行的分离纯化。基本过程是让样品经过凝集素亲和层析,然后进行酶解,再把样品进行二次凝集素亲和层析,再利用 HPLC 分离,进入质谱进行测序等。常用的凝集素主要有刀豆凝集素(convalinaagglutinin,Con A)富集高甘露糖型的糖肽;蓖麻凝集素(ricinus communisagglutinin I,RCA120)能富集末端含有β-1,4-连接半乳糖的糖肽。

2.1.2 肼化学富集法 肼化学富集法用酰肼试剂修饰经氧化处理的糖,是一种传统的糖化学研究方法。一般要经过氧化、连接、蛋白酶解、同位素标记、释放及分析等步骤。处理后的样品用毛细管液相色谱ESI-MASS或毛细管液相色谱MADLI TOF MASS对糖肽进行分析和数据库检索。此法的显著优势在于可以一次收集不同类别的糖类。



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2.1.3 亲水色谱法 亲水色谱是一种采用固定相和非性流动相的色谱技术。目前已有报道将此法与凝集素亲合技术结合利用凝胶电泳进行糖肽的分离富集,这种方法利用了糖链的加入使糖肽的亲水性增强的原理进行的。

2.1.4 β消除米氏加成反应 通过β消除米氏加成反应在修饰位点处连上1个具有较强反应活性的基团比如巯基,从而可以选择性富集目的蛋白/多肽,这种方法已被成功地用于磷酸肽的富集。

2.2 糖蛋白及糖基化位点的确定

2.2.1 PNGase F酶法 这是目前糖蛋白组学研究中应用为广泛的一种N糖蛋白鉴定方法[3]。N糖肽酶几乎可以作用于所有的N糖链,同时使天冬酰胺转变为天冬氨酸,造成相对分子量增加0.98Da,但自然条件下天冬酰胺也会转变成天冬氨酸,因此,如果是切完后的肽段,再用重水PNGase F切是2.98Da;如果trypsin酶切和PNGase F都在重水完成,则是6.98Da;2.98Da会有同位素交盖引起的误差,定量时可以把轻重比例设定大于2才认为有明显的差异,以减少误差。利用质谱仪去检测,可区分自然条件下的发生的酰胺和氨的转变还是发生了糖基化修饰。



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2.2.2 Endo H酶法 与PNGase F不同,内切β-N-乙酰葡糖胺酶H(endo-β-N-acetylglucosa minidase H, Endo H)在去糖基化时会将N-糖链五糖核心中与天冬酰胺相连的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)以外的部分切除,而在糖基化位点处留下GlcNAc,从而起到标记糖基化位点的作用。糖基化位点处的GlcNAc使得该处天冬酰胺残基的相对理化质量增加203,这对于质谱的准确度要求不高。

2.2.3 β消除米氏加成反应 该方法基于在碱性环境中Ser、Thr上的O糖基团会发生消β消除形成1个不饱和的双键,这个双键可以被亲核试剂攻击发生加成反应,使Ser或Thr残基的质量相对其理论质量发生一个特定的变化,也就是使O糖基化位点被质量标记,而且这种质量标记在PSD或CID的条件下是稳定的,从而可以通过串联质谱测序的方法得到糖基化位点的信息。

2.2.4 三氟甲基磺酸(trifluoromethananesulphonic acid,TFMS)法 该法可以切除与肽链直接相连的单糖以外的所有糖基,留下的糖基则起到标记糖基化位点的作用。此方法反应温和,速度较快且可以作用于所有类型的糖链。作为一种高的效温和的方法,TFMS法用于糖蛋白组学的前景还是很诱人的。只是该法在操作时要保持严格的无水条件,且糖链末端唾液酸的存在会影响反应效率。


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