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如约而见,甚是想念!欢迎大家来到单细胞蛋白组文献分享系列第二期,此次为大家带来的是Matthias Mann研究团队发表在Molecular aystems biology(IF=11.429)杂志上的名为“Ultra-high sensitivity mass spectrometry quantifies single-cell proteome changes upon perturbation”的文章,作者开发了一个强大的基于质谱的高灵敏度工作流程T-SCP(true single-cell–derived proteomics),将微型样品制备、极低流速色谱法和新型捕获离子迁移率质谱仪timsTOF SCP结合起来,从而使灵敏度提高了10倍以上,准确且可靠地量化单个FACS分离细胞中的蛋白质组及其变化,从而实现真正的单细胞蛋白组学。
蛋白质组学是对细胞、组织、器官或有机体的蛋白质进行表征。然而,对于单细胞研究是有难度的,主要由于蛋白质没有类似DNA的PCR扩增的方法,因此,任何检测蛋白质的技术都必须足够敏感,这样才能在细胞仅含有微量蛋白质时还能识别它们。这篇文章对于单细胞蛋白组的实验做了以下几方面工作:
一
探究初始LC-MS设置的灵敏度极限
首先,作者引入PASEF(parallel accumulation–serial fragmentation 又称为并行累加–串行碎片,肽离子从捕获离子迁移率(TIMS)装置释放到浓缩包装的真空系统中)的质谱采集方案,在TIMS qTOF仪器上通过数据依赖模式(ddaPASEF)或非数据依赖模式(diaPASEF)高敏碎片化手段,可以得到很高的离子利用率和数据完整性,其中通过dda采集模式和MaxQuant分析0.8 ng HeLa裂解物共鉴定出550种蛋白质。考虑到单个HeLa细胞的蛋白质量低至150 pg ,再加上样品制备中不可避免的损失,550这个数字并非真正单细胞蛋白的结果,因此需要提高灵敏度才能实现真正的单细胞蛋白质组学。
二
构建高灵敏度质谱系统
(1)开发了一个较强的离子源,引入了全新的离子光学元件,优化检测器电压等参数,之后将离子电流增加了4.7倍,构造了一个具有较亮离子源的仪器。接下来对FACS方式分选的0,1和6个HeLa细胞分拣到不同的384孔中,分别进行蛋白处理进行检测,分别识别出824、1364和1946种蛋白质,结果表明与比较六个细胞相比,单细胞的定量准确率没有太大降低。
在此,作者利用基于MS的T-SCP技术和微量样本处理系统,极低流量的色谱法和diaPASEF采集模式与之前的方法相比,识别的蛋白数量显示出显著的优势。
三
方法验证-T-SCP剖析被捕的细胞周期状态
四
单细胞蛋白组与单细胞转录组差异
五
比较单细胞蛋白质组测量和六细胞蛋白质组结果显示此方法可以鉴定大部分稳定表达蛋白。低表达蛋白的CV服从泊松分布,但在高表达蛋白中CV显著降低,这说明低水平表达蛋白的测量变异性受技术敏感性限制。
总结:
该方法可以容易地应用于组织材料的高敏感性分析,以获得的健康和疾病状态的细胞异质性,可以在样本受限的情况下提高测定灵敏度,促进了单细胞蛋白组学的发展。
DOI:10.15252/msb.202110798
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