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蛋白质组学,糖基化蛋白质组学,多组学联合分析
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北京蛋白质组学——N/O糖基化混合解离新技术——ETHcD-sceHCD

2021-12-24 00:00:00

在人类体细胞中仅由两万余个基因编码了超过十万种蛋白形式,这是由于不同的蛋白翻译后修饰对蛋白形式的多样性的贡献。蛋白质翻译后修饰(Post-translational modifications,PTMs)几乎参与细胞所有的生命活动过程,如细胞分裂、蛋白分解、信号传导、调控过程、基因表达调控和蛋白相互作用等。翻译后修饰使蛋白质类型增多、结构更复杂、调控更准确、作用更专一、功能更完善。蛋白质翻译后修饰是影响大多数真核生物蛋白转运、细胞定位、分子间相互作用或活性的重要决定因素,在许多细胞的生理和生化过程中发挥重要作用。常见蛋白质翻译后修饰为磷酸化、泛素化、糖基化和乙酰化等。

质谱(mass spectrometry,MS)是表征翻译后修饰的理想手段,通过测定分子量可以推断出多肽上发生何种翻译后修饰,通过测定二级碎片离子的分子量可以推断出翻译后修饰发生的位点;此外质谱还可以对翻译后修饰进行定量分析,发现与生物学过程或者疾病过程中关联的翻译后修饰位点。在众多的翻译后修饰中,糖基化修饰是复杂的同时也是重要的翻译后修饰之一。蛋白质糖基化修饰分为O-糖基化和N-糖基化,寡糖链连接在天冬氨酸残基上形成N-连接的糖基化,起始于内质网,随后由高度有序的糖苷酶或糖基转移酶在内质网或高尔基体中进一步加工;寡糖链连接在丝氨酸/苏氨酸上形成 O-连接的糖基化,O-糖基化通常发生在高尔基体中。糖基化修饰不仅影响着蛋白质的空间构象、生物活性、运输和定位,在分子识别、细胞通信、信号转导等特定生物过程中发挥着至关重要的作用。据推断,有超过百分之50的蛋白质都发生了糖基化修饰,但由于糖基化的高度复杂性,绝大多数糖蛋白尚未被发现,现有数据中只有约 百分之10的蛋白质被注释为糖蛋白。仅仅由6个不同单糖组成的寡糖链,其结构就可能达到惊人的一千多种。

由于蛋白质糖基化的重要性,科学家们迫切想要了解其在生物体中的作用。随着蛋白质组学的迅速兴起,针对蛋白质糖基化大规模研宄的糖蛋白质组学和糖组学应运而生。糖蛋白质组学和糖组学研究,在发现疾病相关生物标志物,探索诊断与治疗中有可行性,作为一种新的研究策略越来越被科学家们认同。目前基于糖蛋白质组学和糖组学的多方面面蛋白质糖基化研宄主要有三个层次:

1.糖基化定性分析;

2.糖基化定量分析;

3.糖基化功能研宄。

前沿文献案例

四川大学华西医院移植免疫研究室陈又南副研究员和杨浩副研究员团队在Front. Immunol 杂志上发表了题为Sequential Analysis of the N/O-Glycosylation of Heavily Glycosylated HIV-1 gp120 Using EThcD-sceHCD-MS/MS的技术文章,提出了一种连续的糖蛋白质组学工作流程。

破译病毒包膜(Env)糖蛋白的糖基化对于评估病毒逃离宿主的免疫反应以及开发疫苗和抗病毒药物至关重要。然而,尽管糖蛋白质组学在质谱技术和数据分析工具方面取得了重大进展,但准确解码高度糖基化的Env蛋白的位点特异性糖基化特征仍然具有挑战性。因此了解Env糖蛋白的糖基化景观将有助于理解HIV-1感染和疫苗与药物的开发。

作者提出了一种混合解离技术 ETHcD-sceHCD,通过结合电子转移/高能碰撞解离 (EThcD) 和阶梯式碰撞能量/高能碰撞解离 (sceHCD)的糖蛋白组学工作流程。使用这个工作流程作者表征了位点特异性N/O糖基化人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1) Env蛋白gp120。与EThcD相比,EThcD-sceHCD方法增加了已鉴定的糖肽的数量,同时比sceHCD产生更多方面的片段离子,用于位点特异性糖基化分析,特别是可以准确了解O-糖位点分配。

从高度糖基化的gp120中明确分配了18个N糖位点和5个O糖位点。这些结果表明,该工作流程可以实现在一个过程中包含大量潜在糖基位点的高度糖基化蛋白的N/O-糖基化分析的改进。了解Env糖蛋白的糖基化景观将有助于理解HIV-1感染和疫苗和药物的开发。

实验流程




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实验材料

人细胞中表达的重组 HIV-1 gp120 蛋白

实验步骤

重组蛋白使用胰蛋白酶或胰蛋白酶和Glu-C组合消化两种方式。消化产物通过HILIC富集,并使用PNGase F消化。完整的糖肽和去糖基化肽样本分别通过 sceHCD-MS/MS 和 EThcD-sceHCD-MS/MS 两种方式进行检测,下机数据使用 Byonic 软件进行解析并手动验证。

结果与讨论

与单独使用 HCD 或 ETD 相比,ETHcD可以提供更完整的糖肽碎片,并能够观察到更大比例的碎片离子从而确定更多的糖位点。然而,ETHcD 的解离效率仍然有限,特别是对于低电荷密度前体,如糖肽。因此,作者认为使用混合解离技术 EThcD-sceHCD-MS/MS ,可以提供足够的解离效率和更高的谱图质量,因为它可以同时产生 sceHCD 和 ETHcD 谱图。sceHCD-MS/MS 和 EThcDsceHCD-MS/MS 提供了准确的 N-糖位点位置数据和有关N-糖链组成的丰富信息。完整的N-糖肽 (92LTPLCVTLNCTDLR105) 在N100处含有高甘露糖型N-聚糖HexNAc2Hex5。sceHCD-MS/MS谱图包含b/y型肽骨架片段、氧离子和Y离子(y型肽骨架+ 聚糖片段)。在没有完整聚糖 (HexNAc2Hex5) 的情况下,该肽在激活过程中往往会丢失部分 N-聚糖。



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为了分析完整的N/O-糖肽数据,作者使用Byonic软件分析了由sceHCD-MS/MS、EThcD-MS/MS和EThcD-sceHCD-MS/MS产生的完整糖肽类的数据。与使用HILIC富集后的ethtd-sceHCD-MS/MS相比,使用HILIC富集后的sceHCD-MS可以识别出更多的胰蛋白酶-或glu-c酶消化完整的n-糖肽。这些结果表明 ETHcD-sceHCD 扫描比 sceHCD 扫描要慢,从而减少 MS/MS 采集。此外,与使用EThcD-sceHCD-MS/MS 相比,sceHCD-MS/MS 可用于鉴定更完整的 N糖肽。也就是说,EThcD-sceHCD-MS/MS 牺牲了为碎片质量鉴定的完整糖肽的数量。大约一半的胰蛋白酶或胰蛋白酶/Glu-C 消化完整的 N-糖肽可以通过 sceHCDMS/MS 和 EThcD-sceHCD-MS/MS 测定。在 gp120 上的 24 个 PNGS 中,有14个糖位点(N58、N100、N160、N172、N216、N237、N264、N306、N313、N329、N375、N380、N417 和 N432)由 sceHCD-MS/MS 和 EThcD-sceHCD-MS/MS 明确指定。四个糖苷点(N130、N134、N270 和 N276) 由 EThcDsceHCD-MS/MS 明确分配,六个糖位点(N106、N111、N114、N359、N365 和 N369)由sceHCD-MS/MS 或 EThcD-sceHCD-MS。几乎所有的 Nglycosites含有超过50种N-聚糖,其中一半以上是复合型聚糖,其次是高甘露糖型和混合型聚糖,并且鉴定出的 N-聚糖的数量远远超过先前报道的数量。值得一提的是N-糖位点 N106/111/114 和 N359/365/369 位于一种糖肽中。因此,无法提供位点特异性N-糖基化信息。有四种 N-糖位点(N134、N172、N216 和 N237)装饰有多达 100 种不同类型的显着异质 N-聚糖。结果表明:高甘露糖型、复合型和杂合型聚糖的相对丰度分别为百分之 27.8、百分之16.9 和百分之 54.2。

此外,还确定了gp120单个糖位点上前5个N-聚糖的相对丰度。高甘露糖型N-聚糖是在9个N-糖位点(N100、N130、N172、N237、N264、N270、N313、N380和N417)中丰度很高的N-聚糖。



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虽然已知gp120蛋白的O糖位点很少,但对gp120的O-糖基化尚缺乏系统和深入的研究。作者采用完整的工作流程进行完整的O-糖肽鉴定,sceHCD-MS/MS和EThcD-sceHCD-MS/MS谱都可以提供足够的离子信息,可靠地分配O-糖基(T468)和O-聚糖(HexNAc2HexNeuAc2)。与sceHCD-MS/MS谱相比,EThcDsceHCD-MS/MS谱包含c/z型离子和更多的Y离子,保留了完整的O-聚糖。这些信息有助于明确地分配O-糖位点和O-聚糖。此外,完整的O-糖肽(380NNTITLPCR388)包含两个潜在的O-糖位点(T382和T384)。从sceHCD-MS/MS谱可以确定O-聚糖组成(HexNAc2Hex1),但不能确定O-糖位点(T382或T384)。而利用EThcD-sceHCD-MS/MS谱由于存在关键离子,如z6、c7和c8,可以确定O-聚糖组成(HexNAc1)和O-糖位点(T382)。

数据显示,与sceHCD-MS/MS相比,EThcD-sceHCD-MS/MS通常更可靠地生成片段离子类型,足以实现完整O糖肽的稳健表征。



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接下来作者通过结合不同的消化方法(胰蛋白酶和胰蛋白酶/Glu-C)与质谱方法(sceHCD-MS/MS和EThcD-sceHCD-MS/MS)的所有数据,鉴定出了26个潜在的O-糖位点。其中,通过sceHCD-MS/MS和EThcD-sceHCD-MS/MS鉴定出9个潜在的O-糖位点,从胰蛋白酶和胰蛋白酶/谷蛋白酶消化的完整O糖肽中鉴定出10个潜在的O-糖位点。此外,作者还手动分析了这些完整的O-糖肽的光谱。6个O-糖位点可以被准确地分配,20个O-糖位点可以被模糊分配。相比之下,S132,S308,T382,T419与T468这5个O-糖位点可以通过EThcD-sceHCD-MS/MS来确定,因为EThcD-sceHCD可以为具有多个丝氨酸和苏氨酸残基的完整O-糖肽中的O-糖位点提供更多的离子信息。其中T468是5个O-糖修饰很高:HexNAc(1)Hex(1)NeuAc(2)(百分之45)、HexNAc(1)Hex(1)NeuAc(1)(百分之43)、HexNAc(1)(百分之7)、HexNAc(1)Hex(1)(百分之4)和HexNAc(2)(百分之1)



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由于临床对合理设计疫苗和靶向药物的巨大需求,重组gp120的聚糖、糖位点、糖位点、糖苷酶处理的糖肽和糖蛋白的分析已在一些研究中报道。然而,使用位点特异性聚糖信息对完整 N/O-糖肽的分析提供了关于包含许多潜在糖位点的高度糖基化蛋白质的多方面和高度准确的信息。在本研究中,作者使用基于sceHCD-MS/MS、EThecD-sceHCD-MS/MS和Byonic软件,对重组HIV-1gp120完整的N/O-糖肽进行了同时、深入和多方面的分析。用EThcDsceHCD-MS/MS明确确定了18个N-糖位点和5个O-糖位点,用sceHCD-MS/MS明确确定了14个N-糖位点和2个O-糖位点。

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