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「青莲聚焦」修饰蛋白组学之富“甲”一方

2021-11-24 00:00:00

青莲聚焦」修饰蛋白组学之富“甲”一方


       蛋白质的甲基化(Methylation)是指将甲基在酶的作用下转移到蛋白质的某个残基上,通常是赖氨酸或精氨酸,也包括组氨酸、半胱氨酸和天冬酰胺等。赖氨酸侧链上ϵ-氨基上有三个氢可以被替换为甲基,因而赖氨酸上可以有单甲基化、双甲基化和基化3种不同的修饰;而精氨酸有两个可以被甲基修饰的氨基基团,因此γ-氨基精氨酸上可以有单甲基化、对称双甲基化和不对称双甲基化3种修饰,其在生物体内的动态平衡受到赖氨酸甲基转移酶(KMT)和赖氨酸去甲基化酶( KDM)的调控。蛋白质的甲基化是一种普遍的修饰,经常与乙酰化并列,因为它们都是常见的表观遗传修饰,经常发生在组蛋白上,组蛋白甲基化(histonemethylation)是发生在H3和H4组蛋白N端赖氨酸(K)或精氨酸(R)残基上的甲基化。组蛋白甲基化功能主要与形成和维持异染色质的结构、基因组印迹、DNA修复、X染色质的失活和转录等调控方面息息相关。此外,非组蛋白上赖氨酸甲基化也渐渐被发现,参与发育、细胞间相互作用以及信号转导等过程。

     
      青莲百奥甲基化蛋白组学服务,利用很高效液相-质谱联用平台(LC-MS),研究生物或细胞内全部发生甲基化的蛋白质(大规模、高通量)的定性和定量包括蛋白的表达水平、修饰位点、参与的生物学过程以及蛋白与蛋白相互作用等,以期应用到基础医学和生物医药阐述疾病的发病机理及耐药机制),揭示生物胁迫作用。

甲基化蛋白组学流程

案例分析

MRPS23的精氨酸和赖氨酸甲基化通过调节OXPHOS促进乳腺癌转移
 

研究背景
       线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)在调控肿瘤转移中起重要作用。然而,OXPHOS促进癌细胞转移的分子事件和调控机制的详细描述至今仍不清楚。线粒体核糖体蛋白S23 (MRPS23)是高度保守的线粒体核糖体小亚基的组成部分。在心脏病代谢综合征中,MRPS23突变时,呼吸链复合物I和IV中的酶活性降低。此外,MRPS23高表达有助于肝癌和乳腺癌的细胞增殖。然而,MRPS23与人乳腺癌转移之间的关系至今尚未被研究。此外,MRPS23蛋白的翻译后修饰(PTM)尚未得到充分的研究。

 

研究内容
       在这项研究中,研究人员证明了MRPS23的R21和K108位点分别被PRMT7和SETD6甲基化。R21甲基化加速了MRPS23蛋白的多聚泛素依赖性降解到低水平。这种降解克制OXPHOS产生mtROS促进转移。此外R21甲基化和K108甲基化可以协同作用,将MRPS23的稳定性调节到较低水平,从而支持乳腺癌细胞的生存。本研究的结果为深入了解PTMs调控OXPHOS在乳腺癌转移中的作用机制奠定了基础,也为探索PRMT7-SETD6-MRPS23轴作为高侵袭性乳腺癌治疗干预的潜在靶点奠定了基础。
 

研究结果
 

一、MRPS23在R21位点被PRMT7甲基化

       此前研究表明蛋白精氨酸甲基转移酶7(PRMT7)能够促进乳腺癌的转移。研究人员首先对稳定的3×Flag-PRMT7复合物进行了质谱分析(MS),发现MRPS23是PRMT7相互作用蛋白,互作共免疫沉淀证明GST-MRPS23与3×Flag-PRMT7之间存在直接相互作用。

       接着利用质谱手段鉴定MRPS23的精氨酸位点,结果显示5个精氨酸残基(Arg5、Arg21、Arg69、Arg133和Arg157)均为单甲基化。随后研究人员将每个精氨酸残基分别突变为赖氨酸(R5K, R21K, R69K, R133K,和R157K),进行体外甲基化检测,发现MRPS23 R21K降低了MRPS23甲基化(图1f),并利用特异识别MRPS23 R21单甲基化的多克隆抗体,验证了特异性。PRMT7过表达增加了MRPS23 R21的甲基化(图1g),PRMT7敲低可降低内源性MRPS23甲基化程度(图1h),以上结果均证明MRPS23被PRMT7甲基化。

图一

二、MRPS23 R21甲基化通过克制OXPHOS增强乳腺癌细胞转移

        研究人员假设MRPS23的精氨酸甲基化促进乳腺癌转移。首先评估了MRPS23 WT、R21K或R21F对迁移和侵袭的影响,结果表明,MRPS23 R21K与MRPS23 WT和R21F相比迁移和侵袭能力显著下降(图2a, b)。为了证明MRPS23 R21me1在体内细胞转移中的重要作用,作者将MCF7-PRMT7/ MRPS23 WT或MRPS23 R21K注入裸鼠尾静脉,发现与MRPS23 R21K细胞相比,MRPS23 WT细胞注射的裸鼠肺具有明显更高的光通量(Fig.2c),出现了更多肉眼可见的肺转移(Fig.2d),表明MRPS23 R21me1促进了乳腺癌转移。       接下来研究MRPS23 R21甲基化是否调控了OXPHOS。在MCF7细胞中检测PRMT7过表达后OXPHOS在MCF7细胞中被克制(图2e, f),PRMT7敲低显著增加OXPHOS(图2g, h)。因此,MRPS23精氨酸甲基化可能克制OXPHOS生成mtROS,进一步促进迁移。用mitoTEMPO处理MCF7-PRMT7/MRPS23 WT细胞,mitoTEMPO克制细胞的迁移和侵袭能力,说明R21甲基化通过mtROS促进迁移和侵袭。

图二

三、MRPS23 R21甲基化促进了MRPS23蛋白的低水平降解

        作者发现PRMT7过表达或敲低对MRPS23 mRNA的转录水平影响不大(Fig.3a, b),这一现象的直接原因是PRMT7可能影响MRPS23蛋白的稳定性。用蛋白酶体克制剂MG132或蛋白质合成克制剂环己亚胺(CHX)处理MCF7-PRMT7细胞,结果表明,PRMT7促进了MRPS23蛋白的降解(Fig.3c, d),推测PRMT7可能通过R21甲基化影响MRPS23蛋白的稳定性。MG132克制了MRPS23 WT和R21F蛋白的降解(图3f),说明甲基化促进了MRPS23的降解。PRMT7过表达后MRPS23泛素化增加(图3g),MRPS23 WT和R21F泛素化显著增加(图3h)。因此,R21甲基化通过增加MRPS23的泛素化来降低其稳定性。

       随着PRMT7的逐渐增加,MRPS23逐渐下降,直到达到一个较低的水平(图3i),这表明细胞存活可能需要相对较低水平的MRPS23蛋白。通过慢病毒系统过表达了两个针对MRPS23的独立 shRNAs证明这一点。


图三

四、MRPS23 K108甲基化与R21甲基化协同,维持MRPS23的低水平

       此外,作者发现MRPS23赖氨酸甲基化和SETD6也被检测到,表明MRPS23也可能被SETD6甲基化。在MCF7细胞中证实了SEDT6-MRPS23的内源性相互作用(图4a),随后检测到GST-MRPS23与His-SETD6之间存在直接相互作用(图4b),进一步进行了体外甲基化实验,证明MRPS23被SETD6甲基化(图4c)。紧接着进行了质谱分析确定甲基化的赖氨酸位点,(Lys28, Lys57, Lys108和Lys150)被甲基化(图4d)。MS分析显示K108R位点为二甲基化(图4d)。利用特异性多克隆抗体,识别了MRPS23的K108二甲基化位点,发现SETD6敲低可降低K108位点的甲基化(图4f),由此证明MRPS23 K108甲基化是由SETD6催化的。

       研究人员随后探索了K108和R21的甲基化是否协调维持了MRPS23蛋白的低水平。通过检测MCF7-PRMT7和MDA-MB-231细胞在低水平MRPS23环境下赖氨酸和精氨酸甲基化的情况发现当MRPS23蛋白维持在较低水平时,它在K108和R21位点都发生了甲基化(Fig.4g)。SETD6敲低显著降低了MRPS23低水平的蛋白水平(图4h),而SETD6敲低对MRPS23 mRNA水平影响不大。这些数据表明,K108甲基化可能也参与了MRPS23的稳定性,用MG132或CHX处理模型细胞,发现K108甲基化增加了MRPS23的稳定性。K108和R21甲基化协同控制MRPS23的泛素化状态,导致MRPS23蛋白水平较低。


图四

五、MRPS23 K108甲基化通过调节OXPHOS在乳腺癌细胞存活中发挥重要作用

       通过测试MRPS23 K108甲基化对乳腺癌细胞存活的影响发现MRPS23 K108R在MCF7shMRPS23#2细胞中激活了早期凋亡(Fig.5a)并克制了增殖(Fig.5b),表明K108甲基化可以促进乳腺癌细胞的存活。MRPS23和SETD6基因敲低激活了早期凋亡。


图五

六、MRPS23、R21和K108甲基化与高等级别乳腺癌相关

       为了进一步研究MRPS23甲基化如何参与乳腺癌进展,作者比较了MCF10A、MCF7、T47D、BT549和MDA-MB-231细胞中PRMT7、SETD6和MRPS23的表达水平。与MCF7相比,BT549、MDA-MB-231等高转移细胞株中PRMT7、SETD6表达显著升高,MRPS23表达降低(图6a)。说明MRPS23的低表达是由PRMT7和SETD6调控的,从而增加迁移和侵袭。低水平的MRPS23蛋白可能预示着明显的不良预后。为了验证这一假设,对145例乳腺肿瘤标本进行了MRPS23免疫组化(IHC)染色,乳腺组织中低MRPS23蛋白水平预示预后明显不良(图6d)。同时,MRPS23高表达也预示着预后明显不良(Fig.6c, d)。利用抗MRPS23 R21me1和抗MRPS23 K108me2抗体,通过免疫沉淀法检测50例乳腺肿瘤样本中MRPS23的精氨酸和赖氨酸甲基化。结果显示,MRPS23 R21me1和K108me2的水平非常高。MRPS23蛋白水平与MRPS23 R21me1或PRMT7表达呈负相关;而MRPS23蛋白水平与MRPS23 K108me2或SETD6表达呈正相关(图6e, f)。这些结果表明,低水平的MRPS23蛋白与高水平的MRPS23 R21me1和K108me2相关。

图六

总结
       这项研究发现了PRMT7和SETD6诱导的MRPS23精氨酸和赖氨酸甲基化在低水平上调节MRPS23蛋白稳定性,进而克制线粒体OXPHOS,生成mtROS,从而促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭。PRMT7-SETD6-MRPS23轴参与乳腺癌发生的表现,可能通过靶向该轴的成员,为开发潜在的乳腺癌干预治疗策略提供基础。


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       注:在正式实验之前,我们都会对您提供的样品进行质控检测,检测合格后开始正式试验。


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