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「青莲聚焦」历“九”弥新——FFPE蛋白质组学解析肺癌特征

2021-08-12 00:00:00



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通常情况下,蛋白质组学分析的做法是处理新鲜冷冻的肿瘤组织。然而,由于新鲜冷冻标本的肿瘤收集在总样本数量方面会受到限制,并且这些样品往往缺乏足够长的随访信息,导致了其实际的研究意义受限。因此,福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 标本因其长期的稳定性与含有临床结果的常见信息等优势,成为回顾性研究中十分有吸引力的资源。来自柏林Max Delbrück分子医学中心、柏林卫生研究所(BIH)的一组研究人员已经成功地使用质谱仪详细分析了肺癌组织固定样本中的蛋白质。并在Nature Communications杂志上发表了题为Comprehensive micro-scaled proteome and phosphoproteome characterization of archived retrospective cancer repositories的研究论文。








实验流程





Philipp Mertins博士等人评估了(磷酸)蛋白质组学在 FFPE 肺组织上的蛋白质提取、量化、预分析和样本大小的可行性。在比较蛋白质提取方案后,使用的方案并采用串联质量标签 (TMT) 方法从肺鳞状细胞和腺癌中获取深度(磷酸)蛋白质组,其中含有大于8,000个量化蛋白质和14,000多个磷酸化位点。通过微尺度方法,量化了7,000磷酸化位点,从而能够分析具有有限样本量的 FFPE 活检。Philipp Mertins博士等人还研究了分析前变量(包括固定时间和热辅助去交联)对蛋白质提取效率和蛋白质组覆盖率的影响。他们改进的工作流程提供了关于肺癌中最相关的癌基因、肿瘤抑制基因和信号通路的蛋白质丰度和磷酸化位点调控的定量信息。最后,重点介绍了用于重点临床研究的全面(磷酸化)蛋白质组分析的 TMT 方法和用于大型队列的无标记方法。








结果速递






首先比较了三种已发表的从 FFPE 样品中提取蛋白质的方案,由整体蛋白质组覆盖率、肺癌相关的蛋白质组覆盖率以及四次重复的可重复性等方面的结果表明 SDS-SP3在三种测试方案中从肺癌 FFPE 样本中提取蛋白质的效果。



其次,对新鲜冷冻与福尔马林固定标本的蛋白质组进行直接比较,结果显示蛋白质鉴定没有重大差异,其对蛋白质鉴定质量的影响很小。 使用新鲜制备的福尔马林固定细胞进行的细胞系实验也显示,与新鲜冷冻材料相比,蛋白质组和磷酸蛋白质组覆盖率只有很小的差异。表明对于大型临床 FFPE 队列的蛋白质组学分析的研究设计,固定时间不一定是选择标准。同时 TMT 技术可以成功应用于临床 FFPE 样本,提供有关蛋白质表达和磷酸化水平的相关信息。并且TMT方法非常适合对切除的 FFPE 组织进行研究,通过优化 TMT 技术,即使是少量样本也能实现深度蛋白质组覆盖。对于切片的 FFPE 组织,通过 TMT 实验可以定量检测到 8000多种蛋白质和超过14000 个磷酸化位点。
最后对常用 FFPE 蛋白质提取方案、蛋白质组学量化方法和不同 FFPE 样本类型的样本量要求进行系统比较,指出LFQ 只需要少量的样本进行蛋白质组分析,样本制备时间相对较短,在质谱仪上每个样品的测量时间最少。因此,LFQ 特别适合研究中等覆盖率的数百个样本的大型队列。然而,对于磷酸化蛋白质组分析,由于对每个样本的样本量要求相对较高,该方法受到限制。 TMT 方法可提供更深的蛋白质组和磷酸化蛋白质组,但考虑到用于标记、分级和脱盐的额外样品处理步骤,需要相对较高的样本量和更多的样本制备时间。而微尺度 TMT 方法的一个明显优势就是它提供了对蛋白质组和磷酸蛋白质组水平的深入覆盖的同时,又不需要较高的样本量,从而能够对非常小的临床标本(例如针芯活检)进行全面的蛋白质组学表征。




整体而言,质谱驱动的蛋白质组学LFQ 和 TMT 中常用的量化方法在分析 FFPE 组织方面都有不同的应用,各自具有不同的优势和劣势,并在功能蛋白质组水平上提供了多种技术选项来探索癌症基因的改变。

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