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「青莲聚焦」历“九”弥新——单细胞蛋白质组学定量方法新突破!

2021-08-10 00:00:00



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定量单细胞蛋白质组学能够定量检测单细胞内的丰度、翻译后修饰状态等,有潜力成为单细胞转录组学的互补策略。单细胞蛋白质组学的质谱分析(SCoPE-MS)是近年来引入的一种定量分析单细胞蛋白质组的方法。目前,在使用质谱进行单细胞蛋白质组学定量方面,主要是使用平行稳定同位素标签和载体蛋白质组辅助以进行单细胞分析。下面就跟小编一起来看一下这个单细胞蛋白组学定量方法的新进展吧!





近日,来自GenentechChristopher M. Rose 与慕尼黑工业大学Bernhard Kuster团队合作在Nature Methods杂志上发表题为Defining the carrier proteome limit for single-cell proteomics的研究论文,这篇论文给出了载体蛋白质组水平和SCoPE-MS定量准确性之间的关系,为单细胞蛋白质组学的实验设计、数据收集和数据分析提供了指导,同时作者介绍了自己研发的程序SCPComponsion,这个程序能够对单细胞蛋白质组学质谱进行快速的质量控制分析。



研究背景

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同位素标记是一种具有相同的完整质量的化学标签,因为包含独特的质量条形码,可通过报告离子显示,以便在同一分析中对多个样品进行相对定量。同位素标记可以将所有样品的多肽在质谱中以一个峰的形式出现,增加了总体信号,并使多肽离子同时分离。SCoPE-MS利用这一特性,通过将高于单细胞样本100倍至200倍水平的载体蛋白样本加入到单细胞样本中提高整体信号,进而可以进行单细胞蛋白质组的分析。虽然这项技术的出现令人鼓舞,但是当载体蛋白质样本加入的量过高时,从单细胞组获得的数据准确性和它的生物学结论都大打折扣。因此,系统探究并明确载体蛋白质组用量与单细胞蛋白质组学定量准确性之间的关系就显得尤为重要,本文针对这一问题进行了细致的探究和分析。




探究过程及结果

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首先,作者先通过对蛋白质组进行不同TMT标记和不同比例的混合和鉴定,确定了标记的动态范围为在100-300倍,稀释度大于1:100时,测定的变异性就明显增加。

随后,作者模拟了使用5x25x50x100x的载体蛋白质组时,对总体进行不同程度的采样对单细胞测定的变异系数的影响(coefficient of variation,CV),发现当采样水平一致时,载体蛋白质组含量增加,测量变异性(CV)也会增加,随着离子蓄积浓度的增加,测量变异性则会降低,这表明可以通过蓄积更多的离子来克服更高的载体蛋白质组水平的影响,测量变异性越低定量越准确。

随后,作者用TMT标记的多肽和更复杂的蛋白质组样品HeLaK562细胞酶切肽段进行实验,进一步验证了这一结论,表明增加载体蛋白质组水平需要同时增加被离子蓄积的数量,才能保持单细胞蛋白质组学质谱测定中的定量准确性作者将其称为载体蛋白质组效应

1同位素标记动态范围的表征和ScoPE-MS变异性的模拟



2SCoPE-MS中定义载体蛋白组效应


同时,作者还测定了高水平的载体蛋白质组对质量分析器动态范围的挑战,以及多重标记对定量准确性的影响,发现在现在常用的测定参数下,保持定量准确度的最重要的因素还是确保对单细胞样品中的离子进行足够的蓄积

最后,作者介绍了他们做的一个软件工具,叫SCPComponion,它可以快速分析用户提供的SCP-MS数据,进行参数分析和数据特征的检测。



结论

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目前,单细胞蛋白质组学尚处于初级阶段,与单细胞RNA序列分析相比通量还比较低,RNA测序技术无法检测翻译后事件(如磷酸化),而单细胞蛋白组学是可以补充这部分内容的。随着SCoPE-MS的引入,人们开始努力增加SCP- MS分析的深度,未来几年将单细胞鉴定水平将有很大的提高。




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