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「青莲聚焦」我们一起细数微量细胞组学的宝藏

2021-05-28 00:00:00

随着测序技术的发展,生命科学研究早已进入了单细胞时代,可以从单个细胞的维度上探究细胞、组织、器官的发育过程和疾病相关的细胞异质性和同质性问题。生物学问题通常是呈现多维度、复杂的时空网络状的。


样品量受限的样品:

在生命科学研究中,样本的稀缺微量同样是科研路上的一大挑战,这时候便需要更适合微量样本的方法来帮助广大科研学者突破样本量问题这大关。如具有高活力和转移潜能的CTC细胞(循环肿瘤细胞),外泌体,细针穿刺和活检组织切片样品等。


异质性:

细胞的天然特性之一,看似相同的一群细胞,其内部有可能存在本质的差别。这种异质性是由很多因素造成的,除了各细胞所处微环境的差异以外,更多的是细胞内在活动的一种表现。研究者越来越不满足于对单细胞基因组、转录组的测序分析,更希望能够对单细胞蛋白质组进行定性定量分析。通过对生命的重要活动研究,探究单个细胞的蛋白质组是如何变化的。


青莲站在巨人的肩膀上,总结牛人经验,克服了微量细胞蛋白组学研究三大难点,下面我们来看看牛人已经发表的方法吧!


01单细胞的获取

想要检测单细胞,首先要突破如何分离单细胞。

FACS荧光激活细胞分选配合nanoPOTS芯片进行分离。[2]



在显微镜的辅助下,使用毛细管直接从细胞悬浮液中吸取单个细胞至nanoPOTS中进行后续操作。[1]



02样本前处理技术优化

样品量极少,酶解效率低。常规蛋白组样品前处理方法仅适用于大量细胞样品的处理;微量样本体系小,酶解效率需要优化提高。适当放大反应体系,提高酶切效率,研发新的实验流程,降低实验过程损失。

微流控技术:单个细胞鉴定211个蛋白,使用Match between Runs (MBR)鉴定到669个蛋白。[3]


TMT标记单细胞定量蛋白组学:整个实验在离心管中完成,Carrier的存在可以降低单细胞样本的损失,且肽段序列鉴定提供足够的离子,单个细胞鉴定757个蛋白。[6]



03质谱色谱参数优化

单细胞蛋白组学分析中,无法直接使用常规色谱质谱参数,要提高色谱的分辨率和质谱采集方法。降低色谱柱内径,降低流速,明显改善鉴定结果。

当色谱柱内径从75下降到30um,流速从350下降至60nl/min,可见谱图强度有明显提高[5]



当流速从50降低至20nl/min ,肽段鉴定数量增加~50%,蛋白鉴定数量增加~30%,低流速更有助于微量样本分析。[1]



样本类型:原代培养的细胞、组织解离后细胞、体液中分离出的细胞

送样标准:


参考文献

[1] Anal. Chem. 2020, 92, 2665−2671

[2] Angew. Chem. Int. Ed., 2018, 57: 12370-12374

[3] Zhu et al. Nature Communications, 2018,9, 882

[4] Analytical and Bioanalytical Chemistry volume, 2019, 411: 4587–4596

[5] Zhu et al. Int. J. Mass Spectrom.,2018,427, 4–10.

[6] Budnik et al. Genome Biology (2018) 19:161 ASMS2019 poster ThP722


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