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「青莲百奥聚焦」单细胞蛋白质组学助力细胞异质性解析

2021-05-25 00:00:00

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细胞是生命体的小组成单位，遗传及外部环境等因素使单个细胞异质性广泛存在于众多生物体中。传统的生物学实验获得的结果是大量细胞的平均测量值，因此在单细胞层面开展研究对于理解细胞的生长发育以及疾病的诊断与治疗至关重要。蛋白质作为生命活动的主要承担者，可以为其提供更为直接且更有价值的表型信息，因此成为单细胞研究的热点目标。

2021年1月27日，美国东北大学的Nikolai Slavov教授团队在Genome Biology期刊上在线发表了题为“Single-cell proteomic and transcriptomic analysis of macrophage heterogeneity using SCoPE2”的研究论文，该研究采用Minimal ProteOmic sample Preparation (mPOP)样本处理和TMT标记方法，优化了单细胞蛋白质组（SCoPE-MS)的实验流程，进而对单个哺乳动物细胞进行质谱分析，量化细胞分化过程中的单细胞蛋白质丰度和异质性。

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液相质谱联用仪已经能够准确、高特异性和高通量地定量大样本中的蛋白质，但它在单细胞中的应用还处于起步阶段。为了将这些强大的质谱技术应用于单细胞分析，该研究开发了单细胞蛋白质组学质谱(SCoPE-MS)技术。SCoPE-MS引入了使用等压载体的概念，它有三个重要的作用：(1)减少样品损失；(2)在MS1扫描过程中增强离子的可检测性；(3)提供碎片离子以用于肽段序列鉴定。通过将这一概念与MS兼容细胞裂解相结合，建立了应用多重LC-ESI-MS/MS定量单个细胞蛋白质的可行性。

实验流程

SCoPE2的总体工作流程如下图所示。单个细胞被分离在单独的孔中，进行裂解，并将其蛋白质消化成肽。来自每个单个细胞的肽串联质谱标签(TMT)共价标记，因此，具有相同序列(和质量)的标记肽在MS1扫描中显示为相同m/z的峰，质谱仪器会将这些峰分离并将其进一步碎裂。除了产生有助于肽段鉴定的片段外，碎片还产生报告离子(RI)，其丰度反映相应样本(单细胞)中的蛋白质丰度。

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实验结果

SCoPE2相对于SCOPE-MS的主要进展

一、自动化和微型化细胞裂解

SCoPE2不是通过聚焦声波裂解来裂解细胞，而是通过少的蛋白质样品制备（mPOP）裂解细胞。mPOP使用冷冻-加热循环，可在纯水中有效地提取蛋白质，从而避免了MS分析之前的样本损失。mPOP允许在多孔板中制备样品，从而可以与PCR热循环仪和液体分配器并行处理多个样品。这种对SCoPE-MS的改进使SCoPE2能够将裂解体积减少10倍，从10μl减少到1μl，将耗材和设备的成本降低100倍以上，并通过并行处理将样品制备的通量提高100倍以上。

二、提高通量并改善定量

SCoPE2引入了更短的NLC梯度，这允许每单位时间分析更多细胞。此外，采用了更窄的分离窗口（0.7 Th）改善离子分离，从而改善了定量。

三、系统参数优化

主要是利用他们同时开发的DO-MS：质谱法的数据驱动优化。

四、增强的肽段序列鉴定

同时也通过他们组之前开发的DART-ID去做蛋白肽段的鉴定的优化，这样更加准确的知道每条肽段所对应的蛋白。

SCoPE2用于细胞分群

高通量单细胞测量通常用于识别和分类不同细胞。因此，研究人员测试SCoPE2数据执行这种分类的能力。主成分分析(PCA)，PCA使用所有3042种定量的蛋白将细胞分成两个基本离散的簇，这两个簇占数据总方差的29%。对不同细胞进行颜色编码表明，这些簇对应于单核细胞和巨噬细胞（如图1a）。为了评估我们是否可以根据单核细胞和巨噬细胞相关蛋白的丰度来划分细胞类型，我们通过分析单核细胞和巨噬细胞大量样本所确定的差异显著的蛋白质丰度的中位数对每个细胞进行了颜色编码（图1b）。得到的结果与它们的细胞类型一致，从而支持了SCoPE2数据可用于对细胞类型进行分类。

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图1. 通过主成分分析识别不同细胞簇

单细胞蛋白质和RNA数据的联合分析

为了研究RNA和蛋白质水平上的相似和不同，研究人员比较了scRNA-seq和SCoPE2数据的相关性。根据RNA和蛋白质数据集的公共主成分(CPC 1)对单细胞和cluster 1基因(蛋白和RNA变化趋势相同的基因)进行排序，证实了大多数基因表现出相似的RNA和蛋白质图谱。通过对这些基因的基因集富集分析确定了许多生物学功能，包括抗原呈递、细胞粘附、细胞增殖和蛋白质合成等。研究人员还使用Conos生成了一个整合所有分析细胞的联合图，并将它们投影到同一组轴上，如图2d-f。分析显示，在蛋白和RNA水平上都能将两种细胞（单核细胞和巨噬细胞）区分开，但是蛋白的数据更加紧凑，而转录组数据更加分散。这也暗示了RNA水平的检测其生物学和技术变异性更大。

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图2. 单细胞RNA和蛋白质数据的联合分析

结论

SCoPE2提高了单细胞蛋白质质谱分析的可及性、通量和准确性。这些改进使我们能够描述骨髓细胞分化过程中出现的异质性，并探索调控相互作用。所描述的方法学是通用的，可广泛应用于推动描述性单细胞研究向分子机制的定量探索方向发展。

单细胞的蛋白组和转录组联合解析巨噬细胞的异质性

Single-cell proteomic and transcriptomic analysis of macrophage heterogeneity

期刊名称：Genome Biology

IF：10.806

技术策略：单细胞蛋白质组学

青莲百奥在单细胞蛋白质组学方面有着丰富的项目经验，目前已能够实现对50-200个细胞进行蛋白质组学分析。另外还可提供一站式蛋白质组学、代谢组学、转录组学、多组学联合分析等科研服务。青莲百奥在质谱检测方面经验丰富，拥有国际质谱平台，海归坐镇专业生信分析团队，助您在科研道路上乘风破浪，冲击高水平文章。更多技术服务敬请来电咨询：010-53395839。

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