蛋白质组学

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「青莲百奥客户文章」乳腺癌细胞的热蛋白质组分析揭示了CDK4 / 6抑制剂palbociclib的蛋白酶体活化特性

2020-11-03 00:00:00
「青莲百奥客户文章」乳腺癌细胞的热蛋白质组分析揭示了CDK4 / 6抑制剂palbociclib的蛋白酶体活化特性
详细介绍:

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影响因子:IF=10.557
发表期刊:The EMBO Journal
发表时间:2018

      

 乳腺癌占女性癌症发病首位,全球每年有近200万例乳腺癌患者,其中雌激素受体阳性(ER +)乳腺癌患者占比75%。使用动物模型和人乳腺癌标本分析证明的在乳腺组织中,CDK4 /cyclin D1对于癌症的发生至关重要, CDK4 / 6抑制剂具有治疗ER+ 乳腺癌的潜力。Palbociclib(帕布昔利布),Abemaciclib(玻玛西尼)和Ribociclib是目前三种针对CDK4 / 6的特异性抑制剂,这些药物的毒性低,可广泛用于治疗各种肿瘤,在乳腺癌中应用广泛。CDK4 / 6抑制剂既可单独使用,也可以与其他药物一起联用,其临床潜力巨大。自CDK4 / 6抑制剂与激素受体拮抗剂来曲唑的联合使用在乳腺癌中取得显著成功后,近来更多其他组合已进入多种疾病的临床试验,许多早期临床试验的结果显示CDK4 / 6抑制剂可以增强其他信号通路靶点抑制剂的效力。然而,后来一些研究发现还存在其他机制,CDK4 / 6抑制剂不仅仅使细胞周期停滞,还可以导致细胞衰老,改变细胞的代谢,影响T细胞扩增和免疫系统的功能。
      Miettinen等人(EMBO J,2018)使用了一种热蛋白质组分析方法发现了一个Palbociclib诱导的衰老机制。Palbociclib通过降低其与蛋白酶体抑制剂ECM29的结合来激活蛋白酶体,引起衰老反应。蛋白酶体活化是Palbociclib诱导的细胞衰老所必需的。

研究思路

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结果速递

1. MCF7细胞系的热蛋白质组分析

MCF7细胞系是ER+、HER2-的乳腺癌细胞系,对palbociclib敏感。MCF7细胞系分别用10um的palboliclib和水处理1h后,均分为10份,分别37---65℃温度范围中处理3min(图1A;左,中),将热聚集的蛋白去掉,可溶性的蛋白(样品中加入了32种热稳定蛋白做内参用于标准化)进行基于质谱的蛋白质组学分析(10标TMT)。结果共鉴定到5515个蛋白,其中3707个蛋白能够获得高质量的热变性曲线。MCF7蛋白质组热变性曲线的全局分析,49℃是蛋白变性的“灾难点”(图1A;右),这与这与嗜温菌的“热死亡点”以及红白血病细胞系K562的蛋白组热稳定是一致的。 

作者为了研究palbociclib对蛋白热稳定的影响,聚焦到了定量的195个激酶蛋白。在palbociclib与水不同处理对比下,主要的靶标蛋白CDK4与CDK6与预期一样,热稳定性是增加了的(图1.B,C)。CDK4具有所有激酶中第二强的δTm,仅次于磷酸果糖激酶,CDK6 的δTm位列第八位,mTOR也表现出很高的δTm Value(图1.D)。虽然数据表明palbociclib可能影响多种途径,包括PI3K / AKT / mTOR信号通路,但PI3K / AKT / mTOR通路抑制作用较弱且仅在较高的药物浓度下才明显。

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图1.用palbociclib处理的MCF7乳腺癌细胞的热蛋白质组图谱。

 

2. Palbociclib能激活26S蛋白酶体,诱导多聚泛蛋白链降解而不激活整个泛素- 蛋白酶体途径
       

为分析palbociclib对蛋白质复合物的影响,作者绘制可视化的蛋白复合物δTm和δS,发现Palbociclib影响的蛋白复合体涉及到涉及DNA复制(RAD17-RFC和PCNA-CHL12-RFC2-5复合物)和染色质修饰(E2F-6复合物,STAGA和HMGB1-2复合物;图2,A)。 此外,还鉴定了mTORC2复合物和20S蛋白酶体。 由于蛋白酶体活性对于细胞周期的有序进展至关重要,并且由于蛋白酶体受mTOR信号传导调节,并且是人类癌症中的有效药物靶标,作者决定决定更详细地研究蛋白酶体。 完整的26S蛋白酶体由催化核心颗粒20S蛋白酶体和调节颗粒的19S组成。 出乎意料的是,20S蛋白酶体中的所有组分在palbociclib处理时显示出δTm的增加,而19S亚基在很大程度上不受影响(图2,B)。
         蛋白酶活性的探针、泛素G76V-GFP生物传感器检测了酶活性,发现palbociclib 可以激活多肽底物降解,并且这个降解过程可被蛋白酶抑制剂MG132所抑制。通过Western Blot分析了细胞内泛素化的整体水平,表明1lM palbociclib处理降低了MCF7细胞中泛素缀合蛋白的总体水平(图2,G和H),而没有改变20S蛋白酶体水平(图2,G)

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图2.激活蛋白酶体蛋白质降解。

      

 靶向平行反应监测(PRM)质谱分析富集总多聚泛素,该分析证实,在palbociclib处理后,K48、K6、K29和K63链的数量显着减少,这种减少依赖于蛋白酶体活性(图3),如果palbociclib激活整个泛素 - 蛋白酶体途径,当蛋白酶体抑制剂阻断泛素分解时,palbociclib治疗应该增加泛素蛋白链的水平,然而,事实并非如此,当用palbociclib和硼替佐米共同处理细胞时,没有泛素链类型显示出增加现象(图3)。 当用蛋白酶体抑制剂MG-132进行实验时,得到了类似的结论, 总之,这些数据显示palbociclib不会引起蛋白质泛素化的增加,因此,palbociclib诱导的蛋白质降解是由于蛋白酶体的特异性激活。

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图3. Palbociclib在很大程度上独立于遍在蛋白系统而激活蛋白酶体。 用1μMpalbociclib和100nM硼替佐米处理MCF7细胞10小时,并通过靶向PRM质谱法定量泛素蛋白复合体。 


3.Palbociclib通过间接的ECM29介导的机制激活蛋白酶体

体外蛋白酶体活性测定表明增加的蛋白酶体活性不是由于直接的palbociclib对20S蛋白酶体的影响(图4)。用palbociclib或mTOR抑制剂Torin-1处理4小时后用 anti-a4 20S亚基抗体免疫沉淀蛋白酶体,并使用定量质谱法比较蛋白酶体蛋白水平的变化和蛋白酶体的磷酸化位点的改变(图4,D), palbociclib 与Torin-1处理后的发生改变的磷酸化位点Non-overlapping,揭示二者应为完全不同的两条通路。
       那palbociclib是否可以通过蛋白质水平介导其对蛋白酶体的影响?Palbociclib诱导的蛋白质水平变化远大于Torin-1诱导的变化(图4,E),有可能是改变蛋白酶体的结构或者组装。同时,作者观察到19s亚基在Palbociclib存在的时时下调的,PSME3(蛋白酶体激活复合物亚基3),ECM29(蛋白酶体支架蛋白)具有Palbociclib诱导的下调的特性(图4,E)。ECM29,是一个204KDa的蛋白,在酵母中被证实具有抑制蛋白酶体活性的功能,与20S蛋白酶体的结合可改变蛋白酶体构象(De La Mota-Peynado等,2013),这可能解释了ECM29从蛋白酶体解离后20S热稳定性的增加。siRNA介导的ECM29沉默增加了MCF7和HeLa细胞中的蛋白酶体活性(图5,A)。ECM29敲低后,palbociclib处理细胞,并不会像蛋白酶体活性探针Me4BodipyFL-Ahx3Leu3VS和UbG76V-GFP降解实验中那样促进蛋白酶体活性(图5,A)。因此,ECM29 是palbociclib诱导的蛋白酶体活性所必需的,表明ECM29介导palbociclib诱导的蛋白酶体效应。

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图4. Palbociclib间接激活蛋白酶体并减少ECM29与蛋白酶体的结合。


4.ECM29对正常细胞增殖至关重要,其表达可预测乳腺癌中的无复发存活

CRISPR/Cas9基因编辑的方法敲低了MCF7细胞中的ECM29 的表达,建立一个杂合敲除ECM29 的细胞系,该细胞系表现出增殖缓慢的表型,ECM29敲除细胞也大得多,并且许多细胞对酸性β-半乳糖苷酶活性染色呈阳性,这是细胞衰老的确定标记(图5,D)。另外其他两个衰老相关标记,组蛋白H2A.X(cH2AX)S139磷酸化和p21蛋白水平,在siRNA沉默ECM29的MCF7细胞中均是上调的(图5,E、F、 G ,)。这表明ECM29或相关的蛋白酶体活性可能参与细胞衰老的调节,这使得EMC29成为palbociclib诱导蛋白酶体激活的可能介质。
      作者通过关于无复发乳腺癌患者存活的公开可用基因表达数据检查了ECM29的潜在乳腺癌关联(Gyorffy等,2010),数据表明ECM29的表达应作为潜在的生物标志物进行研究,以更好地鉴定那些单独使用palbociclib或与内分泌治疗相结合的个体(图5)。

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图5. ECM29介导palbociclib诱导的蛋白酶体激活,可作为palbociclib治疗乳腺癌疗效的推定生物标志物。

5.palbociclib诱导的细胞表型需要蛋白酶体活性

为了为了获得蛋白酶体活性增加可限制乳腺癌细胞的生长的完整视图,作者通过WB 实验检测了Palbociclib诱导的MCF7细胞系内源性蛋白降解情况,数据表明Palbociclib除直接抑制CDK4 / 6激酶活性外,长期使用palbociclib还可以通过蛋白酶体依赖性的CDK4降解产生的正反馈抑制细胞增殖。使用palbociclib和硼替佐米分别或共同处理分选出MCF7和T47D细胞系G1期细胞,硼替佐米可抵消palbociclib对蛋白酶体的激活,可以超越palbociclib诱导的两种细胞系G1期阻(图6),因此说明蛋白酶体活性的增加对palbociclib诱导的细胞周期的阻滞是必要的。作者还检测了组蛋白H2A.X(cH2AX)Ser139磷酸化的水平,其是细胞衰老和DNA损伤的标志物(图7,A和D),表明palbociclib可能在DNA损伤积累和/或修复中起作用。总而言之,这些结果表明,palbociclib对蛋白酶体的激活对于诱导衰老样状态至关重要,palbociclib对蛋白酶体的激活是药物作用模式的一部分。

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图6.高蛋白酶体活性参与palbociclib诱导的G1期阻滞。


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图7.蛋白酶体抑制抑制palbociclib诱导的衰老表型。


总结

Palbociclib是一种CDK4 / 6抑制剂,被批准用于转移性雌激素受体阳性乳腺癌。除了导致G1细胞周期停滞,palbociclib治疗还会导致细胞衰老,这是一种不易被抑制CDK4 / 6解释的表型。为了鉴定palbociclib诱导衰老的分子机制,作者对MCF7乳腺癌细胞进行了热蛋白质组分析。除了影响已知的CDK4 / 6靶标外,palbociclib还能诱导20S蛋白酶体的热稳定作用,尽管它不直接与之结合。进一步研究表明,palbociclib治疗独立于泛素蛋白途径(PRM靶向相对定量分析泛素结合蛋白)增加蛋白酶体活性,导致细胞衰老,但可被蛋白酶体抑制剂抵消)。Palbociclib诱导的蛋白酶体活化和衰老由ECM29的蛋白酶体结合减少介导,ECM29的缺失激活蛋白酶体,阻断细胞增殖,并诱导衰老表型。之后,还发现ECM29 mRNA水平可预测内分泌治疗乳腺癌患者的无复发生存率。总之,热蛋白质组分析鉴定蛋白酶体和ECM29蛋白作为乳腺癌细胞中palbociclib活性的介质。



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