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「青莲百奥客户文章」我们就是Nature文章的幕后参与者

2020-11-03 00:00:00
「青莲百奥客户文章」我们就是Nature文章的幕后参与者
详细介绍:

在动植物体内病原相关分子模式(PAMP)可以激活先天性免疫。钙在植物中一直被认为是一个重要的信号,用来诱导PAMP免疫。但是PAMP诱导钙信号的传导机制仍旧不清楚。

2019年7月17日加州大学伯克利分校栾升课题组和首都师范大学李乐攻团队在Nature杂志上发表了题为“A calmodulin-gated calcium channel links pathogen patterns to plant immunity”的研究性论文,青莲百奥完成了BIK1磷酸化CNGC4-CT特定位点的质谱鉴定工作。该论文研究发现在植物中当钙的供给充足时,编码环核苷酸门控通道(CNGC)蛋白CNGC2和CNGC4可以组装成一个功能性的钙通道。在静息状态时钙通道被钙调蛋白封闭,当病原体入侵时这个通道可以被效应激酶BIK1磷酸化而被激活,从而引起胞浆钙浓度升高。该研究揭示了CNGC介导的钙流入是PAMP引发PTI免疫的中间桥梁。


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文章中作者详尽阐明了CaM门控的CNGC2-CNGC4通道作用机理模式图。在病原体出现之前,PRR是处于失活状态,CNGC2-CNGC4 Ca2+通道是关闭的,这一过程是以CaM依赖的方式来维持静息Ca2+的水平;当病原体出现后,PAMP就会和PRRs结合,PRRs进一步使BIK1磷酸化而活化,接着BIK1可以使RBOHD磷酸化,RBOHD的磷酸化促进了ROS的产生。活化的BIK1也可以直接活化CaM门控的CNGC2-CNGC4通道复合体,引起Ca2+的流入。产生的ROS能被感应器感知,使CaM门控的CNGC2-CNGC4通道更进一步活化,引起Ca2+的持久流入。因此,CaM门控的CNGC2-CNGC4通道介导的Ca2+流入和ROS的产生形成了一个正反馈环路,传递防御信号并提高免疫输出。
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钙离子调控植物免疫的重要性虽然已经被研究了很久,但分子机制的研究一直没有被揭示。本研究将PAMP诱导钙信号的传导机制,分子作用靶点详尽阐明。例如文章中BIK1磷酸化CaM门控的CNGC2-CNGC4通道复合物,Ca2+要流入必须要得到CNGC2-CNGC4通道的允许,同时CaM门也要开启。这就好比你去找导师汇报工作,要提前预约好时间,得到导师的同意后你才能去找,到了办公室门口你发现门还是关着的,你不能直接破门而入。首先,你要敲门,再进去;你敲门的方式还有讲究,不能太重,也不能太轻,太重显得粗鲁,太轻导师不容易察觉;敲门的位置也要到位,你要在特定的位点去敲门,不能去敲门角,门框。你去找导师汇报工作,这看似很简单的事情却也这么复杂。Ca2+要流入胞浆这一很简单的生理过程也是经过了复杂的调控。科研就是将这一看似简单却又复杂的过程阐明。

文章中作者详细介绍了Ca2+流入胞浆时通过CaM门控的CNGC2-CNGC4通道的分子机理,其中关键的一步就是BIK1磷酸化CNGC4-CT的特定位点。这么关键的一块作者是怎么设计实验的呢?青莲百奥帮你来解答。文中作者用200ng的GST-BIK1和2ug TF-CNG4-CT底物,在25ul含有1mM ATP的激酶缓冲液中30℃下共孵育1小时,之后用SDS上样缓冲液终止反应;反应后的蛋白样品用SDS-PAGE胶进行分离,再用考马斯亮蓝染色;TF-CNGC4-CT的条带切胶后用胰酶消化,液相色谱法串联质谱的技术用于肽段的鉴定,鉴定结果通过比对拟南芥数据库,其中可变修饰设置成磷酸化(S/Y/T)。下面就来看看本文中我们为作者筛选到的磷酸化位点。
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那么,这些位点是怎么分析到的呢?接下来就为你们介绍下这个原理吧,知其然而知其所以然这才是做科研要追求的嘛。

其实,上面位点的确定就是根据质谱的二级图谱得到的。如果您想知道怎么看二级质谱图,首先要明白什么是by离子。肽段在能量作用下会生成一个个by离子对,我们实际检测到的二级离子的质荷比的分布就是二级质谱图,用实际检测与理论形成的离子匹配后的图谱也称为b,y离子匹配图。

就拿文章中第1个二级谱图举例吧,左面的为b离子,右边的为y离子,yHLCLDLVR理论生成的by离子对为:如果是yH中间断开,则生成b1=y(从左往右数),y8= HLCLDLVR(从右往左数8个)第二个与第三个氨基酸中间断开,生成b2=yH, y7= LCLDLVR,依次类推……。你的肽段修饰氨基酸是第1个y(已经小写),一价b1=y,不带修饰的y理论分子量为181-18(yH连接是脱了水的)=163,我们检测到的一价y8分子量为968,而总的分子量为1211,那么y的分子量就是1211-968=243,检测到的分子量比理论值多243-163=80,刚好是磷酸化修饰的分子量,所以b1离子的质荷比说明他是被磷酸化修饰了的。其余肽段氨基酸位点的修饰同理。想通了是不是就觉得很简单呢?

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