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Nature Communication|TRIB3通过抑制FOXO1的降解和增强SOX2转录促进乳腺癌的干性

2020-10-23 00:00:00
Nature Communication|TRIB3通过抑制FOXO1的降解和增强SOX2转录促进乳腺癌的干性
详细介绍:


中国医学科学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室崔冰、胡卓伟研究团队发表了题为“TRIB3  supports  breast  cancer  stemness by  suppressing  FOXO1 degradation  and  enhancing  SOX2  transcription”的文章,发现TRIB3通过抑制FOXO1的降解和增强SOX2转录促进乳腺癌的干性。


TRIB3通过抑制FOXO1的降解和增强SOX2转录促进乳腺癌的干性

研究背景
乳腺癌干细胞的存在是乳腺癌化疗、放疗后发生转移和复发的重要原因。考虑到TRIB3可感知多种应激信号,增强的TRIB3表达导致乳腺癌患者预后差,推测TRIB3通过其肿瘤启动能力参与乳腺癌的发病机制。

实验材料

转基因小鼠上皮细胞;乳腺癌组织;肿瘤细胞系;自发乳腺癌小鼠来源的原代肿瘤及PDX模型。
技术路线



研究结果

TRIB3与乳腺癌的干性有关

从数据库查询发现乳腺癌患者(n=1556)的TRIB3表达水平高于正常患者(n = 144),肿瘤组织的TRIB3表达高于邻近非肿瘤组织(图1 b)。TRIB3在上皮细胞HMLER与8种不同的乳腺癌上皮细胞系中普遍高表达,但在人乳腺上皮细胞(HMLEs)中不表达(图1c)。使用在线工具研究癌症基因组(TCGA)数据库,根据1117名乳腺癌患者的乳腺癌干细胞BCCs中TRIB3的相对表达水平分为三组,TRIB3 mRNA高表达的肿瘤患者总生存期明显低于低或中表达患者(图1d),说明TRIB3表达升高与乳腺癌的进展、转移和复发呈正相关。IL-6处理提高了MCF7细胞的成球能力(图1e),IL-6增强了TRIB3在细胞中的表达。从自发性乳腺癌小鼠的分离乳腺上皮细胞(MEC),在管腔型MMTV-PyMT乳腺癌小鼠的CD24 + CD29亚群和CD24 + CD90 +茎状亚群中、患有her2型MMTV-ErbB2乳腺癌小鼠的CD24 + CD29亚群中以及来自CD68 +肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的乳腺癌患者中均发现了TRIB3 mRNA和蛋白表达(图1f, g)。这些数据表明,升高的TRIB3表达将促进乳腺癌干细胞的细胞因子和其他压力因素与乳腺癌干性相关。



图1 高TRIB3表达与乳腺癌的总生存期和无转移生存期呈负相关

MMTV-PyMT转基因小鼠和MMTV-ErbB2转基因小鼠的上皮细胞中沉默TRIB3 ,形成的球体比对照组少得多(2a,b)。转染阴性TRIB3的HMLE细胞,会促进球蛋白的形成(图2e),沉默TRIB3的细胞表现出较弱的球状体形成能力,可抑制肿瘤生长和转移(图2d, f)并降低了免疫缺陷小鼠形成肿瘤的能力(图2i)。



图2 沉默TRIB3可抑制球状体的形成和肿瘤的定植

TRIB3通过FOXO1转录增强SOX2的表达

过表达TRIB3的HMLE细胞显著提高了SOX2的mRNA表达,促进胚胎干细胞关键蛋白SOX2、NANOG和癌基因产物c-Myc的表达(3b)。SOX2与三种细胞中TRIB3的表达普遍相关,沉默SOX2减少了HMLE细胞中肿瘤球的形成。在HMLE-TRIB3细胞中,沉默SOX2、NANOG、c-Myc中任何一个都可使肿瘤球减少,然而,仅沉默SOX2完全阻断了TRIB3促进肿瘤球形成(图3a-c)。表明SOX2是介导支持TRIB3的乳腺癌干性的主要因素。乳腺癌组织研究发现,SOX2在肿瘤组织中的表达高于邻近的非肿瘤组织,且TRIB3与SOX2在肿瘤组织中的表达水平相关(图3d)。TRIB3增强了HMLE细胞和MCF7细胞中SOX2的转录活性(图3e,f)。沉默SOX2表达降低了用表达TRIB3的载体转染HMLE细胞形成球形(图3g)。过表达SOX2挽救了沉默的TRIB3在MCF7和MDA-231细胞的球状形成能力(图3h)。这些数据提示SOX2表达的升高与TRIB3支持的乳腺癌干性有关。


图3 TRIB3增强了SOX2在BCCs的表达

检测控制BCCs中SOX2表达的主导转录因子(TF),在MCF7细胞中对9种不同的SOX2促进因子逐一进行筛选和沉默,发现沉默FOXO1表达(图4a)而不沉默任何其他TF(补充图4a)可以降低BCCs中SOX2的表达。沉默FOXO1表达可降低转染TRIB3表达载体在HMLE细胞中SOX2的转录活性和表达(图4b,e)。FOXO1的过表达挽救了TRIB3沉默的MCF7细胞的SOX2转录活性(图4c)。FOXO1的过表达挽救了SOX2在TRIB3沉默的MCF7细胞(图4f)和MDAMB-231细胞中的表达。这些数据表明FOXO1增强了TRIB3-过表达BCC中SOX2的转录表达。乳腺癌人肿瘤组织的免疫组化分析,FOXO1的表达水平与肿瘤组织中TRIB3的表达水平相关(图4g)。沉默FOXO1表达则减少了HMLE细胞过表达TRIB3(图4h)。这些数据表明,FOXO1与SOX2作用相同,共同促进过表达TRIB3乳腺癌的干性。



图4 在BCCs中,FOXO1控制着TRIB3-SOX2轴

TRIB3增强了FOXO1的表达

在HMLE细胞中,TRIB3显著提高了FOXO1降解的半衰期(3 ~ 6 h)(图5a)。沉默TRIB3可使FOXO1的半衰期从3.1小时降至0.8小时。蛋白酶体抑制剂MG132可以抑制FOXO1在MCF7细胞中的降解(图5c),沉默TRIB3可以降低MCF7和MDA-MB-231细胞中FOXO1的表达(图5d)。这些数据表明,TRIB3会通过破坏泛素—蛋白酶体系统干扰FOXO1的降解。过表达TRIB3降低了HMLE细胞中FOXO1的S256、T24和S319的磷酸化(图5e)。沉默TRIB3增强了MCF7细胞中S256, S319处的FOXO1磷酸化,但在T24处没有(图5f)。TRIB3抑制了HMLE细胞中S256D FOXO1突变体的泛素化(图5 g)。这些数据表明FOXO1在S256处的磷酸化是FOXO1泛素化和降解的关键信号。过表达FOXO1增加了BCC中肿瘤球的形成,S256A、K463R和S256A K463A突变体FOXO1进一步增强了TRIB3沉默的MCF7细胞中肿瘤球的形成。

图5 TRIB3通过抑制FOXO1蛋白的泛素化来稳定FOXO1蛋白

TRIB3持续降低了AKT1的磷酸化,AKT1是一种可以与FOXO1相互作用的激酶,这表明AKT-FOXO1相互作用在TRIB3增强的乳腺癌干性中起着关键作用。在MCF7细胞中TRIB3不与FOXO1发生内源性作用,但会消除AKT1-FOXO1在HMLE细胞中的相互作用(图6)。研究表明FOXO1并不是影响TRIB3的核心因子, TRIB3-FOXO1-SOX2轴的正反馈机制促进乳腺癌干性。TRIB3通过抑制FOXO1的降解来增强FOXO1的表达,升高的FOXO1诱导SOX2的转录表达,后者反过来激活FOXO1的转录表达。

图6 TRIB3消除了AKT-FOXO1相互作用

干扰TRIB3/AKT相互作用可降低癌症干性

Pep2-Ae降低了MMTV-PyMT和MMTV-ErbB2转基因小鼠的MEC和PDX小鼠的原代BCC的乳腺球群细胞形成能力,对原发性肿瘤的生长没有显着影响,但在FVB小鼠和免疫缺陷小鼠中,继发性肿瘤形成的能力降低。事实上,在MMTV-PyMT MECs衍生的乳腺肿瘤和PDX乳腺肿瘤中,TRIB3/AKT1相互作用被取消。最后Pep2-Ae增强了AKT1和FOXO1的活性,并降低了FOXO1和SOX2在MMTV-PyMT MEC源性乳腺肿瘤和PDX源性乳腺肿瘤中的表达。

这些数据证实,阻断TRIB3/AKT1相互作用可降低乳腺癌干性,并通过促进FOXO1磷酸化、泛素化和降解发挥抗肿瘤作用,从而抑制SOX2的表达(图7)

图7 TRIB3表达升高促进了BCSCs和乳腺癌的发生发展



结论

乳腺癌干细胞的存在是乳腺癌化疗、放疗后发生转移和复发的重要原因,研究发现高表达TRIB3阻碍FOXO1-AKT相互作用,导致核 内FOXO1和SOX2大量堆积,促进乳腺肿瘤干性增强,加速肿瘤发展进程,提示抑制肿瘤干性可能为降低乳腺癌复发和减少癌细胞耐药的发生提供新策略。


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