蛋白质组学

北京青莲百奥生物科技有限公司

领跑智慧多组学,助力科研新发现


服务咨询热线

010-53395839

蛋白质组学,糖基化蛋白质组学,多组学联合分析
您当前的位置 : 首 页 > 案例鉴赏 > 客户发表

Cell Reports|TRIM32/USP11调控ARID1A稳定性以及调控鳞状细胞癌发生发展

2020-10-23 00:00:00
Cell Reports|TRIM32/USP11调控ARID1A稳定性以及调控鳞状细胞癌发生发展
详细介绍:


青莲的客户实在是太啦!

又双叒叕发高分文章啦!

2019年的文章年终盘点才刚刚结束,

紧接着2020年的Paper都已经发发发了~



下面就跟着小编来看看由中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院分子肿瘤学国家重点实验室刘芝华课题组在Cell Reports杂志上发表的文章TRIM32/USP11 Balances ARID1A Stability and the Oncogenic/Tumor-Suppressive Status of Squamous Cell Carcinoma,系统地揭示了泛素化与去泛素化过程在调控ARID1A稳定性以及鳞状细胞癌发生并进一步发展中的关键作用。
640.png


泛素化是一种可逆的动态翻译后修饰,通过E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶依次介导完成。大多数发生泛素化修饰的底物蛋白通常会被蛋白酶体(UPS)降解,但有些也会影响它们的蛋白活性、定位以及相互作用等。相反,去泛素化酶通过清除、重编辑底物上的泛素链来逆转泛素化修饰。泛素化与去泛素化修饰广泛渗透到几乎所有的细胞生命活动当中,其异常调控与包括肿瘤在内的多种人类疾病密切相关。迄今为止,尽管也有一些线索提供了关于ARID1A泛素化修饰,但是其泛素化与去泛素化稳态的失衡在人类肿瘤中的作用尚不明确。


发文时间
2020年1月7

样品选择96例食管鳞状细胞癌(ESCC)组织



实验设计

640.jpg



   结果展示
    1.ARID1A主要由C端的泛素-蛋白酶体系统(UPS)进行调控

为了评估ARID1A在鳞状细胞癌中是否起到重要作用,研究人员对96例鳞状细胞癌(SCC)患者进行了IHC分析以检测ARID1A的表达情况,发现ARID1A的低表达与患者较差预后相关(图A)。进一步探讨在SCC细胞中UPS是否能调节ARID1A,采用蛋白酶体抑制剂MG132处理KYSE30, KYSE180, and NCI-H596三株鳞状细胞癌细胞系,发现MG132处理后ARID1A的蛋白表达水平显著升高(图B)。脉冲追踪显示,在永生化的人食管上皮细胞系NE2和NE3中,ARID1A蛋白比在SCC细胞系中更稳定(图C)。进一步研究发现ARID1A主要由C端的泛素-蛋白酶体系统(UPS)进行调控。

640 (1).jpg

为了确定ARID1A通过泛素化修饰的特定赖氨酸位点,在293T细胞中共表达FLAG-ARID1A和血凝素-泛素(HA-Ub),对FLAG标签下拉的免疫共沉淀物进行质谱(MS)鉴定,检测泛素化位点,检测到ARID1A八个泛素化赖氨酸位点(图A)。为了说明调节ARID1A稳定性的关键E3连接酶和DUB,用质谱检测了FLAG-ARID1A相关蛋白,结果显示了5种E3连接酶和4个DUB与ARID1A相互作用(图B)。


640 (2).jpg

2、泛素连接酶TRIM32能够显著促进ARID1A的泛素化降解

接下来,研究人员选择了四种与ARID1A有显著的关联的E3连接酶进一步研究。敲除TRIM32, RFWD2, TRIP12, 和 MID2,利用免疫印迹(IB)分析只有TRIM32在不影响ARID1A 的mRNA表达水平的情况下提高ARID1A蛋白表达水平的显著影响(图A、B),且在ARID1A高表达的正常上皮细胞及鳞状细胞癌中,ARID1A的半衰期比其在低表达的鳞状细胞癌中要高很多(图C、D)。研究人员经验证发现TRIM32通过降解ARID1A来促进SCC增殖和耐药。


640 (3).jpg


3、USP11是维持ARID1A稳定的去泛素化酶

通过质谱鉴定发现4种去泛素化酶与ARID1A相关,数据指示ARID1A与USP11或USP39之间的特定相互作用。利用免疫印迹(IB)分析发现USP11缺失后,ARID1A表达量明显降低,而USP39缺失未表现出ARID1A的明显下调。值得注意的是,ARID1A的mRNA表达水平通过USP11或USP39基因敲除保持不变。在鳞状细胞癌中过表达USP11蛋白可以显著抑制其增殖与转移,而进一步敲降ARID1A可以完全逆转USP11的抑癌功能,说明ARID1A是USP11在鳞状细胞癌中的关键作用底物。通过CO-IP实验证明TRIM32和USP11可以相互作用,TRIM32的存在显著降低了USP11与ARID1A之间的关联。



4、USP11通过稳定转移ARID1A来抑制SCC增殖

为了验证USP11在SCC中的作用,我们首先在NCI-H596细胞中过表达野生型和突变型USP11,结果显示野生型USP11能抑制NCI-H596细胞的迁移和侵袭。为了验证USP11的肿瘤抑制功能依赖于ARID1A,我们在USP11过表达的KYSE30细胞中敲除了ARID1A,结果表明,ARID1A的敲除可消除USP11在KYSE30细胞中的抑癌功能(图A、B、C)。又进一步验证证实USP11通过稳定转移ARID1A来抑制SCC增殖。

640 (4).jpg


进一步分析表明,TRIM32高表达水平与预后不良、转移和晚期病理阶段有关,表明其是SCC中的一个关键癌基因,并具有可能成为治疗靶点。相反,USP11高表达水平与良好的预后相关,尽管它与其他临床变量没有显著的相关性(图D)。


5、TRIM32/USP11平衡ARID1A稳态并影响SCC的干细胞、肿瘤发生和耐药性

为了探讨TRIM32过表达或USP11缺失引起的ARID1A不稳定性如何促进SCC的发展的潜在机制,通过RNA测序(RNA-seq),与对照相比,发现在ARID1A缺失细胞和USP11缺失细胞中均有33个基因显著上调。重叠的基因中研究人员关注到SDC2,以往研究表明SDC2被认为是SCC的诊断指标。通过一系列实验验证证实TRIM32和USP11控制RAD1A的稳定性,且TRIM32能促进肿瘤的形成,而USP11/ARID1A抑制KYSE180细胞在体内的肿瘤形成。研究人员还发现ARID1A的缺失通过激活跨膜受体SDC2的表达来激活癌症相关信号通路如PI3K/Akt, MAPK, Wnt通路等。


但其在SCC中的调控和功能机制尚不清楚。我们发现SDC2激活致癌信号,如PI3K/Akt、RAS/MAPK和Wnt/LRP6信号通路,以促进SCC开始和进展。与在细胞核中发挥致癌功能的TRIM32不同,SDC2位于细胞膜上,因此,靶向SDC2的抗体的发展应用于ARID1A低表达的鳞状细胞癌患者的治疗方法具有潜在意义。


小结
这项研究系统地揭示了泛素化与去泛素化过程在调控ARID1A稳定性以及调控鳞状细胞癌发生发展中的关键作用。此外,TRIM32与USP11在调控ARID1A蛋白稳定性方面存在拮抗关系,但TRIM32对ARID1A的泛素化和USP11对ARID1A的去泛素化依赖于不同的赖氨酸位点;因而说明ARID1A的稳定性可能取决于TRIM32和USP11的相对表达水平。


参考文献
Luo Q,Wu X,Nan Y,TRIM32/USP11 Balances ARID1A Stability and the Oncogenic/Tumor-Suppressive Status of Squamous Cell Carcinoma.Cell Rep 2020 Jan 07;30(1)


步骤虽繁 必不敢省人工

试剂虽贵 必不敢减物力

咨询热线:



北京青莲百奥生物科技有限公司

固话:010-53395839
邮箱:service@qinglianbio.com
地址:北京市海淀区永丰产业基地绿海大厦C座301


扫一扫,关注我们